皮层蛋白受磷酸化调控机制的荧光共振能量转移分析

朱建伟^1,2* 陆毅祥² 马利林¹ 黄宝玉¹ 刘培根¹ 詹熙²

南通大学附属医院, ¹普外科, ²临床医学研究中心, 南通226001

摘要 : 皮层蛋白(cortactin)是一种癌基因蛋白，是酪氨酸磷酸化激酶Src的作用底物，到目前为止，皮层蛋白受磷酸化调控的机制还不清楚。本研究用荧光共振能量转移(FRET)分析皮层蛋白受磷酸化调控后的蛋白质结构变化，推测皮层蛋白受磷酸化调控的可能机制。采用蓝绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)作为配对，设计和构建基于皮层蛋白羧基端SH3功能的蛋白质传感器，转染NIH/3T3细胞，将细胞以过钒酸盐(PV)和PP2处理，人为诱导或抑制细胞蛋白磷酸化，比较皮层蛋白的磷酸化和非磷酸化状态FRET的不同; 进一步观察皮层蛋白磷酸化位点突变后FRET的变化，以此判断皮层蛋白的磷酸化作用后结构的变化。所设计的生物传感器供体和受体工作良好。FRET分析显示，在PP2处理后， FRET能量变化明显较对照组增高，但用PV处理后， FRET下降。皮层蛋白的磷酸化位点突变后，产生的FRET明显较野生型皮层蛋白产生的FRET为弱。因此推测，皮层蛋白在磷酸化后其分子结构处于“展开”状态，并可能以此增强和其他细胞蛋白的相互作用。