CRISPR-Cas9介导AAVS1安全港敲入构建稳定表达hMSR1与细胞膜锚定荧光蛋白的HEK293A细胞系
黄雅冰1,2 李正航1,2 池铭威3 贝祝春2* 徐勤1* 宋亚彬2* 黄雅冰1,2 李正航1,2 池铭威3 贝祝春2* 徐勤1* 宋亚彬2*
(1广州中医药大学青蒿研究中心, 广州 510000; 2军事医学研究院病原微生物生物安全全国重点实验室, 北京 100071; 3广州中医药大学科技创新中心, 广州 510000)
摘要 :
该研究旨在通过定点敲入人巨噬细胞清道夫受体1(human macrophage scavenger receptor 1, hMSR1)和细胞膜锚定荧光蛋白基因以提高HEK293A细胞的黏附性能, 并对细胞膜进行荧光标记。采用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关蛋白9基因编辑技术, 将hMSR1和荧光蛋白双顺反子表达基因盒定点整合至HEK293A细胞的安全港位点腺相关病毒整合位点1(adeno-associated virus integration site 1, AAVS1)构建稳定细胞系。通过PBS冲洗后的结晶紫染色测定细胞黏附性能; 用CCK-8染色法检测细胞增殖活性; 通过荧光素酶报告基因检测细胞转染效率及其对信号通路的应答; 通过荧光显微成像分析荧光蛋白细胞定位。研究筛选获得4个目的基因正确整合的重组细胞克隆系, 其贴壁性均远高于野生型HEK293A细胞, 并有正确定位于细胞膜的荧光蛋白表达, 且没有增殖活性的显著改变与基础信号通路应答的缺失。
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