BaP通过ROS介导的线粒体自噬通路诱导骨细胞MLO-Y4死亡
金雨昕1# 张涛2# 郑羽茜1 洪书玉1 刘嘉诚1 徐宁晟1 倪嘉璇1 张云1*
该文旨在探究苯并芘(benzo[a]pyrene, BaP)对骨细胞MLO-Y4线粒体自噬的作用及其分子机制。采用MTT法检测不同浓度BaP对MLO-Y4细胞活力的影响, 通过化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量。应用Hoechst 33342/PI双荧光染色观察细胞死亡情况; JC-1染色检测线粒体膜电位; Mito-tracker染色观察线粒体形态变化; DCFH-DA与MitoSOX染色分别检测细胞总活性氧(ROS)及线粒体ROS(mtROS)水平; 化学比色法、荧光素酶法分别测定细胞中丙二醛(MDA)与ATP含量; Western blot检测动力相关蛋白1(Drp-1)、线粒体外膜转位酶20(TOM20)、线粒体融合素1(MFN1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、E3泛素连接酶Parkin、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)及NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)的蛋白表达水平; 免疫荧光染色观察LC3B与线粒体的共定位及聚集情况。结果显示, 与Control组相比,BaP(50、100 μmol/L)处理组MLO-Y4细胞活力、线粒体膜电位、ATP含量以及MFN1、p62、Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著降低, 而细胞LDH释放量、细胞ROS与mtROS及MDA含量显著上升,Drp-1、PINK1、Parkin、NQO1蛋白表达水平与LC3-II/LC3-I值明显升高, 且LC3B与线粒体的共定位及其在线粒体中的聚集程度显著增强。与BaP(100 μmol/L)组相比, Baf A1干预可明显增加细胞内LC-3II与p62蛋白累积, 3-MA能显著恢复细胞活力, 降低细胞死亡率; 线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)与N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预可显著下调PINK1、Parkin的蛋白表达, 降低LC3-II/LC3-I值, 同时上调p62蛋白水平, 有效提升细胞活力并抑制细胞死亡。综上, BaP可通过ROS介导的线粒体自噬通路诱导MLO-Y4细胞死亡。
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