基于CRISPR/Cas9系统筛选影响非小细胞肺癌骨转移的RNA修饰相关基因
杜凤麟1 任逸喆2 张凌飞3 程亚玲1 赵明娜2 张先洲2 刘畅2 娄加陶1,2,4*
该文探讨了RNA修饰相关基因对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)骨转移的影响及其机制。构建靶向118个RNA修饰相关基因的CRISPR/Cas9敲除文库, 采用慢病毒感染人NSCLC H460 BM(H460 bone-metastatic)细胞, 经裸鼠髂外动脉注射构建骨转移模型进行体内筛选; 利用高通量测序技术分析体内筛选后细胞中单向导RNA(single guide RNA, sgRNA)的分布,并应用MAGeCK-RRA算法进行数据分析以鉴定关键基因; 通过siRNA在H460 BM细胞中敲低候选基因METTL3, 采用qRT-PCR和Western blot验证其敲低效率, 并检测上皮−间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白表达; 进一步通过敲低与回补并结合qRT-PCR、Western blot及Transwell侵袭实验, 验证EML4在METTL3下游介导EMT进程的功能; 利用TIMER、PanCanSurvPlot等数据库分析METTL3在肺腺癌组织中的表达及预后价值。结果显示, METTL3在阴性筛选中排名首位, 其sgRNA在体内模型中显著耗竭; 敲低METTL3能有效抑制H460 BM细胞的侵袭, 并下调间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达、上调上皮标志物E-cadherin表达, 且显著降低EML4的表达水平; 回补EML4可逆转METTL3敲低介导的EMT抑制及细胞侵袭能力减弱效应, 证实METTL3通过正向调控下游靶基因EML4的表达驱动EMT进程; 生物信息学分析显示, METTL3在肺腺癌组织中的表达水平显著高于正常组织, 且其高表达与患者总生存期较差相关。该研究证实, 基于CRISPR/Cas9的系统性筛选能有效发现功能基因; RNA修饰相关基因METTL3通过上调EML4表达, 进而调控EMT进程, 在NSCLC骨转移中发挥关键作用。
中文版
英文版