基于CRISPR/Cas9系统构建TIA1基因突变的人诱导多能干细胞系

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TIA1-P362L突变的人诱导多能干细胞(iPSCs)系, 并使其分化为运动神经元, 为研究TIA1突变导致肌萎缩侧索硬化症(ALS)的分子机制及药物筛选 提供细胞模型。利用CRISPR在线工具设计sgRNA, 将其构建到pX330载体中, 扩增左右同源臂并 将其构建到供体载体中, 接着对该供体载体的靶位点进行突变以获得同源重组的Donor质粒。将 sgRNA和Donor质粒同时电转到野生型iPSCs系C11中, 经G418抗性筛选获得单克隆, 利用PCR和 Sanger测序鉴定基因型, 采用Western blot鉴定TIA1蛋白表达情况, 并用核型分析、免疫荧光染色、 定量反转录PCR及拟胚体(EBs)三胚层分化对TIA1-P362L突变的iPSCs系进行多能性鉴定, 通过抑 制SMAD信号通路诱导iPSCs分化为运动神经元并用特异性抗体验证。该研究成功建立具有TIA1- P362L突变的iPSCs系, 该细胞系正常表达TIA1蛋白, 具有多能性且能成功分化为运动神经元, 对阐 明TIA1在ALS疾病中的作用具有重要意义。