敲除端粒酶TERC基因的人Calu3细胞模型的构建及功能验证

张晓娜¹ 郭鸿斌² 程龙³ 徐山茸⁴ 金蕊^3* 田沈^1*

(¹ 首都师范大学生命科学学院, 北京 100048; ²陆军边防第三六一团卫生队, 西藏 859600; ³ 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所, 北京 100089; ⁴安庆师范大学生命科学学院, 安庆 246133)

摘要 :

该文基于一种可诱导的DD-Cas9系统构建敲除端粒酶TERC基因的人Calu3细胞模型, 并对其功能进行验证。将靶向TERC序列的sgRNA克隆至载体pLenti-DD-Cas9-Flag上, 慢病毒包装后感染Calu3细胞, 对筛选获得的单克隆细胞添加小分子化合物甲氧苄啶(trimethoprim, TMP)药物诱导Cas9蛋白表达, 实现对端粒酶RNA组分的敲除。单克隆细胞培养后鉴定其端粒酶活性、端粒长度的变化, 并进行细胞衰老染色的实验。结果显示成功构建了pLenti-DD-Cas9-Flag-sgTERC重组质粒, 并利用DD-Cas9高效、便捷的特点完成了对TERC基因的可诱导性编辑。测序结果表明, 单克隆细胞中TERC序列部分敲除; TRAP实验显示端粒酶活性均有下调; 提取细胞基因组用qPCR的方法进行端粒长度检测, 结果显示其端粒长度明显缩短; 同时, 与野生型细胞相比较, TERC序列敲除的细胞出现明显衰老。总之, TERC基因的缺失导致细胞出现端粒酶活性下降、端粒长度缩短及衰老的现象, 可诱导敲除端粒酶TERC基因的人Calu3细胞模型为后续对细胞衰老相关研究奠定了基础。