过表达Atg5通过上调细胞自噬水平抑制瓣膜间质细胞成骨样分化
陈彬 张盟浩 范梦恬 吴静红 王玥 黄琴 施琼*
该文的主要目的是探究过表达自噬相关蛋白Atg5对主动脉瓣膜间质细胞自噬水平以及成骨样分化能力的影响, 为钙化性主动脉瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路。从猪主动脉瓣上分离原代瓣膜间质细胞, 细胞免疫荧光进行表型鉴定后, 采用成骨培养基诱导瓣膜间质细胞成骨分化, 并用Western blot检测细胞成骨指标Runx2、OPN与自噬指标p62和LC3B-II/I的蛋白表达水平; 构建重组质粒pAdTrack-ATG5并通过脂质体转染瓣膜间质细胞, 采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光染色检测转染后细胞Atg5的表达水平和细胞自噬水平的变化情况; 对成骨诱导培养的主动脉瓣膜间质细胞分别转染空载质粒和过表达Atg5质粒, 利用Western blot检测72 h后瓣膜间质细胞早期成骨指标Runx2、OPN的表达, 并用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色方法检测瓣膜间质细胞晚期成骨样分化能力。结果显示, 原代分离培养的瓣膜间质细胞的间质细胞标志物α-SMA和vimentin的染色结果呈阳性, 内皮细胞标志物vWF的染色结果呈阴性; 与对照组比较, 用成骨培养基培养的瓣膜间质细胞Runx2、OPN和p62的蛋白表达水平显著上调, LC3B-II/I的比值显著下调; 测序结果显示, 过表达质粒pAdTrack-ATG5构建成功; 在转染pAdTrack-ATG5后, 细胞Atg5的基因表达水平和蛋白表达水平均显著上调, 自噬指标p62蛋白表达水平显著下调, LC3B-II/I比值显著上调, 免疫荧光染色显示, LC3B聚集增加; 与转染空载质粒组相比, 转染pAdTrack-ATG5组细胞在成骨培养基培养72 h后成骨指标Runx2、OPN的蛋白表达水平显著下降, 转染pAdTrack-ATG5组碱性磷酸酶染色和茜素红S染色结果的阳性程度均弱于转染空载质粒组。综上所述, 过表达Atg5能上调细胞自噬水平, 并抑制瓣膜间质细胞成骨样分化。
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