沙蚕蛋白酶的荧光标记及细胞摄取机制研究

摘要 : 该文利用FITC对沙蚕蛋白酶(NAP)进行荧光标记, 并通过薄层色谱法、红外光谱法、 紫外光谱法及荧光光谱法对标记物进行表征, 紫外分光光度法计算标记度。通过测定NAP与FITCNAP 的酶促反应动力学参数来比较NAP在标记前后的活性, 同时应用MTT法考察NAP标记前后对 NCI-H1299细胞毒性的影响。流式细胞术研究NCI-H1299细胞摄取FITC-NAP的机制, 荧光显微镜定 性观察NCI-H1299细胞对FITC-NAP的摄取。结果表明, 每分子标记物约含1.78分子FITC, 其最佳荧 光激发波长为490 nm、发射波长为515 nm; 荧光标记后NAP的活性未受到显著影响; NCI-H1299细 胞对FITC-NAP的摄取与药物浓度、作用时间呈正相关; 氧化苯砷组的荧光强度低于FITC-NAP组且 有极显著差异(P<0.01), 因此NAP的摄取机制为内吞。进一步研究发现, NCI-H1299细胞摄取NAP受 到网格蛋白依赖性内吞和小窝/脂筏蛋白介导的内吞共同作用。荧光显微镜观察发现, 随着时间的 增加, 更多的细胞摄入FITC-NAP, 且主要分布在细胞膜及细胞质中, 细胞核中未见分布。