利用CRISPR/Cas9技术对miRNA-125a进行基因编辑的实验研究

摘要 : 近年来, CRISPR/Cas9技术被迅速应用于生物学研究的各个领域。miRNA-125a已被证 实与生殖密切相关, 研究者在自然流产的患者中发现了异常的miRNA-125a。该研究利用CRISPR/ Cas9技术在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中对miRNA-125a进行了定点编辑。对于定点敲除, 我们首先在pX458表达载体的基础上额外引入一组启动子和sgRNA骨架序列用于片段敲除, 此后 分别设计用于单点敲除和片段敲除的sgRNA进行表达载体的构建, 表达载体转染HTR8细胞后通 过流式分选和T7EI酶切鉴定阳性单克隆; 对于定点敲入, 我们在体外构建供体载体, 与CRISPR表 达载体共转染HTR8细胞, 通过流式分选和PCR鉴定阳性单克隆。DNA测序结果显示, 敲除及敲入 阳性单克隆细胞系在指定区域的碱基序列发生了改变; RT-qPCR结果显示, 阳性单克隆细胞系中 miRNA-125a-5p和miRNA-125a-3p的表达量较野生型也发生了相应变化; 体外实验还显示, miRNA- 125a有抑制HTR8-S/Vneo细胞系增殖及迁移的功能。研究证实, CRISPR/Cas9技术在细胞系中编辑 miRNAs是有效可行的, 且对于miRNA-125a的定点敲除, 片段敲除的效果要好于单点敲除。