利用CRISPR/Cas9技术制备B2M–细胞模型
李戊玲1 沈俊杰2 钱程1,2*
1浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018; 2第三军医大学西南医院, 生物治疗中心, 400038 重庆
摘要 : I型主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex class I, MHC I)是造成 免疫排斥的重要分子, 该研究利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)技术靶向其β2微球蛋白(beta-2 microglobulin, B2M)亚基实现MHC I的敲除, 并在分子和细 胞水平进行验证。设计针对B2M基因的gRNA(guide RNA)并构建对应的CRISPR/Cas9基因敲除质 粒, 通过电穿孔转染技术将同时带有Cas9蛋白与gRNA骨架的质粒瞬时转入HEK293细胞中进行蛋 白表达与基因组核酸切割, 流式分选得到HEK293 B2M阴性细胞, 提取其基因组并对gRNA靶向区 域与脱靶区域进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR), 将PCR产物连接T载体测序检 测基因打靶与脱靶情况。同时, 利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)与实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)测定B2M基因在RNA水平的表达。综上所述, 该研究发现了一种利用CRISPR/Cas9技术快速 便捷、低成本的可用于敲除B2M基因的方法, 经检测可使目的细胞中B2M基因发生移码、插入、 缺失、单碱基突变, 且未发现脱靶现象, 这在未来解决免疫排斥相关难题上意义重大。
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