沉默Smad8基因对小鼠卵泡颗粒细胞增殖的影响

余道伦1,3# 陈芳慧2# 张莉1 王和建1 陈杰1 张宗猛1 李洁1 邢朝凤1 李君1* 蔡亚非1,2*

1安徽师范大学生命科学学院重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室, 芜湖 241000; 2南京农业大学动物科技学院; 南京 210095)

摘要 :

SMAD8(又称SMAD9)蛋白质是TGF-β/SMADs信号通路中重要的转录因子。该研究利用RNA干扰技术沉默Smad8基因, 探讨该基因对小鼠卵泡颗粒细胞增殖的影响。免疫组化技术对SMAD8在小鼠卵泡的表达进行定位, 设计并合成Smad8-siRNA转染小鼠颗粒细胞, 荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测Smad8基因沉默效率, CCK-8法分析颗粒细胞增殖能力, ELISA检测细胞上清中雌二醇(E2)和孕酮(P4)浓度, qPCR检测颗粒细胞促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)、促黄体素受体(luteinizing hormone receptor, LHR)以及与细胞增殖相关的细胞周期调控蛋白基因Cyclin D2和CDK4 mRNA水平。结果显示, SMAD8仅表达于卵泡的颗粒细胞, Smad8-siRNA有效抑制了Smad8的表达(P<0.01), Smad8沉默后颗粒细胞的增殖能力明显减弱,细胞上清中E2水平显著下降, P4水平未受影响, 颗粒细胞 LHR、Cyclin D2和CDK4 mRNA水平明显降低, FSHR mRNA无明显变化。以上结果表明, 沉默Smad8基因降低了小鼠颗粒细胞的增殖能力,其机制可能与沉默Smad8调低了颗粒细胞增殖分化相关的E2合成以及LHR、Cyclin D2和CDK4的表达下降有关。