杂交兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选
林榕燕1,2,3 钟淮钦1,2,3 黄敏玲1,2,3* 樊荣辉1,2,3 吴建设1,2,3
1福建省农业科学院作物研究所, 福州 350013; 2福建省农业科学院花卉研究中心, 福州 350013; 3福建省特色花卉工程技术研究中心, 福州 350013
摘要 : 为了给杂交兰的基因功能表达和调控研究提供内参基因, 本研究采取同源克隆方法和RT-PCR技术, 以杂交兰‘黄金小神童’叶片为材料, 分离杂交兰Ch18S rRNA、Ch28S rRNA、ChACT、ChTUA、ChTUB、ChUBQ、ChEF-1α和ChrpoB基因的片段, 以10个不同品种杂交兰叶片及‘黄金小神童’花器官不同部位为材料, 利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)检测分析各引物的扩增效率和相对表达量, 采用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对各个候选内参基因的表达稳定性进行分析, 并通过研究杂交兰花器官不同部位ChPDS基因的表达模式来验证筛选得到的内参基因的可靠性。结果显示, 各引物扩增的片段长度分别为171 bp、148 bp、183 bp、146 bp、130 bp、147 bp、203 bp、139 bp, 扩增效率分别为1.94、2.19、1.88、1.99、2.12、2.20、2.11、1.98。综合3个软件的评价结果发现, 杂交兰不同品种叶片中最佳内参基因为ChACT, 不同花器官部位中最稳定内参基因为ChACT、ChTUB、ChUBQ和ChEF-1α; 而对于实验中所有样品来说, 内参基因稳定性最高的为ChTUB; 说明不同的实验条件下, 所需的内参基因不同。ChPDS基因相对表达水平分析结果证实了所筛选内参基因的可靠性, 以ChUBQ、ChEF-1α、ChTUB、ChACT及ChUBQ和ChEF-1α基因组合进行校正的ChPDS基因的相对表达量均为花瓣>唇瓣>蕊柱。
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