利用单细胞PCR技术高效筛选鉴定CRISPR/Cas9介导的lncRNA敲除克隆细胞株

摘要 : CRISPR/Cas9技术可简便、快捷、高效地实现基因的敲除。敲除长非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)时需同时引入1对guide RNA, 将lncRNA基因组的全部或者大部分片段敲除, 以实现目的基因功能的缺失。现有鉴定lncRNA敲除细胞株所用的方法一般需单细胞增殖至较多数量, 敲除效率较低且筛选耗时耗力。LncRNA DANCR(differentiation antagonizing non-protein coding RNA)在干祖细胞的干性维持过程中起重要作用, 且与多种癌症的发生有关, 但其作用机制仍未完全明确。作者针对DANCR基因组的3′及5′端设计sgRNA并同时转染到人红白血病细胞系(K562)中。为建立一种高效筛选鉴定lncRNA敲除细胞株的方法, 他们先后采用了基因组DNA PCR、少量细胞PCR、单细胞PCR这3种方法来鉴定lncRNA DANCR的敲除情况, 系统比较了3种检测方法的优缺点。该文成功建立了利用单细胞PCR技术高效筛选鉴定CRISPR/Cas9介导的lncRNA敲除克隆细胞株的方法。这一方法适用于其他lncRNA敲除情况的鉴定, 有助于lncRNA的功能及机制研究。