基于CRISPR/Cas9技术的GATA-1基因敲除K562细胞系的构建

摘要 : GATA-1(GATA binding protein-1)在造血分化过程是最重要的转录调控因子, 在红细
    胞和巨核细胞中特异性高表达, 并通过调节相关基因的转录在红系和巨核系造血细胞的分化发育过程中发挥重要作用。该研究采用CRISPR/Cas9技术将K562细胞中的GATA-1基因敲除, 建立了GATA-1基因敲除K562细胞株。首先, 设计了4个CRISPR的靶向位点, 利用pGL3-U6-sgRNA-PGKpuromycin质粒构建了4个导向RNA(single guide RNA, sgRNA)载体。利用电穿孔的方法将sgRNA载体与Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9共转K562细胞。转染48 h, 经定点PCR和T7EN1内切酶酶切鉴定后, 采用细胞有限稀释法嘌呤霉素筛选, 定点测序和Western blot检测结果显示, 成功构建了GATA-1基因敲除K562细胞株, 命名为K562-KO GATA-1。使用联苯胺染色和流式细胞术的方法检测血型糖蛋白A(glycophorin A, CD235a)发现, 与正常K562细胞相比, K562-KO GATA-1细胞株经Hemin诱导红系分化明显受到抑制。综上, 该研究建立了敲除GATA-1的K562细胞系, 可用于后续的造血分化相关研究。