CALR基因在MDS患者中的表达及其对细胞生长和凋亡的影响

摘要 : 该文研究了钙网蛋白(Calreticulin, CALR)基因在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic
    syndrome, MDS)患者中的表达, 并构建了CALR-RNAi慢病毒载体, 观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞生长和凋亡的影响。反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)检测34例低危、高危MDS患者、8例非MDS患者骨髓标本及细胞株中CALR的表达; 设计3条含靶向沉默CALR基因的Oligo DNA, 与酶切后的GV248质粒连接形成表达载体, 经筛选、鉴定后得到3种GV-CALR-RNAi重组慢病毒载体。分别转染SKM-1细胞, 流式细胞术检测转染效率, RT-PCR及Western blot验证干扰效果,筛选出最佳靶向序列。然后, 使用含最佳靶向序列的慢病毒载体转染SKM-1, CCK-8法和Annexin V/7-AAD双染法分别观察其对细胞生长和凋亡的影响, Western blot检测caspase-3的表达。34例低危、高危MDS患者中有31例检测到CALR基因表达较正常组明显降低(P<0.01)。成功构建了3种CALR-RNAi慢病毒载体, 流式细胞术检测平均转染效率在70%以上。RT-PCR及Western blot检测结果显示, CALR-RNAi(3)慢病毒载体敲除效率最高, 为最佳靶点。结果发现, CALR-RNAi(3)转染SKM-1后可促进细胞生长、抑制细胞凋亡(P<0.05), 同时CALR-RNAi(3)组的G0/G1期细胞减少, S期细胞增多。Western blot证实凋亡因子cleaved-caspase-3的水平降低。CALR基因在MDS中起到抑癌基因的作用, 构建的 GV-CALR-RNAi(3)重组慢病毒载体有利于进一步研究CALR基因在MDS中的作用机制。