PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对弱精子症精子mtATPase6基因突变的检测
金龙金* 张春玲 楼哲丰1 张李雅2 陈林丽 李 玮 吕建新
温州医学院生命科学学院, 浙江省医学遗传学重点实验室; 1生物学实验中心; 2温州医学院附属第一医院生殖医学中心; 温州325035
摘要 : 为了检测弱精子症精子mtATPase6基因突变， 采用PCR方法扩增了17例弱精子症mtDNA 8 602~9 416区域815 bp目的片段， 用MspI和HaeIII限制性内切酶酶切， 分别用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和单链构像多态性(SSCP)筛查突变。筛选出3例突变标本， 经测序确认突变位点和突变性质。结果显示17例标本全部扩增出mtDNA 8 602~9 416的815 bp目的片段， PCR产物经MspI限制性内切酶酶切后电泳结果与剑桥序列预期酶切图谱相一致。PCR产物经HaeIII酶切， 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上出现泳动带的异常， 在17例弱精子症中共筛选出2例酶切片段异常标本。PCR-HaeIII酶切产物的SSCP电泳图谱分析结果显示， 在PCR-RFLP(HaeIII)电泳图谱正常的15例弱精子症标本中筛选出1例异常。两种方法在弱精子症精子标本中筛选出mtATPase6基因突变3例(3/17， 17.7%)。3例测序结果发现A8701G、C8943T、C8964T、T8966C、G9053A、C9060A、C9075T、A9120G、C9296T共9个点突变， 其中A8701G、T8966C、G9053A三个突变为错义突变， 其余均为同义突变。上述结果提示， 弱精子症精子mtATPase6基因存在较高突变率; PCR-RFLP和PCR-SSCP能简单、快速、灵敏地筛选mtATPase6基因突变。
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