同时表达活化型IGF1、EGF和FGF2的慢病毒载体的构建

郑丹丹^1# 叶景佳^2# 杨蓓蓓^1* 曹江^2*

¹浙江大学医学院附属第二医院耳鼻咽喉科, 杭州 310009;²浙江大学医学院附属第二医院临床研究中心, 杭州 310009

摘要 : 共培养体系及添加外源性生长因子是诱导干细胞向内耳样细胞分化研究中的常用手
段。为了将两种方法结合用于研究, 该实验设计了一种可同时表达三种活化型生长因子的慢病毒载体。活化型表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)编码序列采用RT-PCR方法从SW620人大肠癌细胞中克隆, 活化型胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)编码序列为人工合成。用PCR方法分别从pSecTag2A和pIRES2-EGFP质粒中克隆出引导分泌的免疫球蛋白Igκ链信号肽编码序列和引导翻译的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)序列。将Igκ链信号肽和三种因子的编码序列分别融合、由IRES间隔并克隆到带绿荧光蛋白报告基因的慢病毒表达质粒pLVX-IRES-ZsGreen1上并包装获得慢病毒。将慢病毒感染HEK293T细胞, 通过有限稀释法筛选出稳定表达绿荧光蛋白的单细胞克隆。用Western blot检测单细胞克隆的IGF1、EGF和FGF2的表达, 并通过促进肺癌A549细胞生长实验验证了分泌的生长因子的活性。该研究成功构建了导入细胞后可同时表达活化型IGF1、EGF和FGF2的慢病毒载体, 为今后设计可表达这三种因子的共培养工程细胞用于干细胞诱导分化提供了有力的工具。