细胞周期蛋白D1特异性核酶表达载体的构建及其活性

摘要 : 应用mfold程序对锤头状核酶(ribozyme， Rz)和大鼠细胞周期蛋白(cyclin) D1基因的二级结构进行分析， 设计合成锤头状Rz基因， 通过RT-PCR扩增获得大鼠细胞周期蛋白D1目的基因， 将Rz基因和细胞周期蛋白D1基因分别克隆入载体pGEM-3Zf(+)中， 体外转录Rz基因和靶基因并进行切割实验; 将Rz基因与逆转录病毒载体pLXSN重组得到Rz真核表达载体pLXSN-Rz， 将其转染入HSC-T6细胞， G418筛选出阳性细胞克隆， 用RT-PCR检测细胞周期蛋白D1基因的表达。结果显示: 针对目的基因的832位点设计合成了Rz832， 成功获得Rz832基因、细胞周期蛋白D1 mRNA的体外转录载体pGEM3Zf-Rz832和pGEM3Zf-cD1， 经体外转录出Rz832 (105 nt)及细胞周期蛋白D1 mRNA (1 079 nt)。体外切割实验证实Rz832能够特异性切割细胞周期蛋白D1 mRNA， 产生1 014 nt和65 nt的切割产物， 切割效率为80%。所构建的pLXSN-Rz832经酶切电泳、PCR鉴定显示， 插入的Rz832序列大小约为57 bp， 与预期结果相同， 经测序证实Rz832序列正确。转染pLXSN-Rz832的肝星状细胞(hepatic stellate cells， HSCs)细胞周期蛋白D1 mRNA的表达受到明显抑制， 仅为对照组的42.22% (t=-193.443， P<0.01)， 结果表明: Rz832能够在体外特异性切割细胞周期蛋白D1 mRNA、并在HSC-T6细胞内有效抑制细胞周期蛋白D1基因的表达。