AKT基因转染人脐带间质干细胞来源exosomes的分离及鉴定

摘要 : 该研究构建人AKT基因重组腺病毒载体(Ad-AKT), 转染人脐带间质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSC), 分离hucMSC分泌的exosomes, 检测exosomes中的成分变化, 为exosomes的临床研究提供实验基础。该实验设计含有EcoR I、Xho I的限制性酶切位点的引物, PCR扩增AKT, 将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的穿梭质粒上。重组穿梭质粒经线性化处理后, 与腺病毒骨架质粒在Stbl3中重组, 筛选获得含有AKT的重组腺病毒质粒, PCR鉴定并测序。重组病毒质粒用Pac I酶切线性化, 转染293A细胞, 制备高效表达的Ad-AKT, 并转染hucMSC。结果表明, AKT基因重组腺病毒能高效转染hucMSC,hucMSC中AKT蛋白表达增多, 并且转染AKT基因的hucMSC来源的exosomes(AKT-MSC-exosomes)中AKT蛋白也增多, 说明通过基因修饰可以获得过表达目的蛋白的exosomes, 为exosomes的来源及应用研究提供可选择的方法。