活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR蛋白的应激动力学行为
高星杰1# 张 毅2# 付 雪3 苏 超1 张春燕3 张桂敏3 尹 洁1 王鑫廷3 姚 智3 杨 洁1,3*
1天津医科大学基础医学研究中心, 天津 300070; 2天津医科大学药学院, 天津 300070; 3天津医科大学基础医学院, 天津 300070)
摘要 : 人类抗原R(human antigen R, HuR)是一种多功能RNA结合蛋白, 参与细胞应激颗粒(stress granules, SGs)的构成。SGs是细胞在受到外界环境刺激时在胞浆中形成的颗粒状结构。该研究是利用光漂白荧光损失(fluorescence loss in photobleaching, FLIP)技术对活细胞内的HuR蛋白颗粒进行应激动力学分析。首先, 利用脂质体将RFP-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞, 以Western blot和细胞免疫荧光实验确定是否实现对于HuR蛋白的红色荧光蛋白(red fluorecent protein, RFP)标记; 然后以405 nm激光束脉冲式重复光漂白HuR应激颗粒, 分别监测同一漂白细胞内的其他HuR颗粒以及核内荧光信号, 并以邻近的未漂白细胞作为对照组。实验结果表明, 转染重组质粒后可有效表达RFP-HuR融合蛋白, 且与SGs标记蛋白G3BP存在共定位关系。在第一个光漂白循环, 漂白区荧光密度便从2 500 a.u.降低至0 a.u.; 而经过约12个漂白循环(240 s)后, 邻近HuR颗粒的荧光密度从漂白前的1 800 a.u.左右降低并维持在200 a.u.左右, 表明活细胞内的HuR颗粒呈现高度的动态性; 而胞核区荧光密度亦从4 400 a.u.降低至2 000 a.u.左右, 表明HuR蛋白是一种核浆穿梭蛋白, 在SGs、胞浆及胞核之间存在一定的动态平衡。利用FLIP技术可以分析并比较SGs不同成分的应激动力学属性, 有助于进行SGs相关临床疾病的分子机制探讨。
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