活细胞内人AGTR1-3′UTR的荧光标记及应激定位分析

张毅^1,2,3,4,5,6# 高星杰^3,4,5,6# 付雪^3,4,5,6 苏超^3,4,5,6 史雪彬^3,4,5,6 段中潮^3,4,5,6 付晓^3,4,5,6 何津岩³ 杨洁^3,4,5,6*

¹天津医科大学药学院, 天津 300070; ²天津市临床药物关键技术重点实验室, 天津 300070; ³天津医科大学基础医学院, 天津 300070; 4天津医科大学基础医学研究中心, 天津 300070; ⁵天津市细胞与分子免疫学重点实验室, 天津 300070;

摘要 : 利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构(含有MS2蛋白结合位点)的RNA之间的高度亲和力, 对外源性人血管紧张素1型受体(angiotensin II receptor type 1, AGTR1) mRNA 3′端非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)片段进行红色荧光标记, 进而在活细胞(HeLa)内研究该mRNA片段的应激生物学行为。通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3′UTR和24×MS2, 构建重组质粒pSG5/AGTR1-3′UTR/24×MS2, 并将该质粒与重组质粒pERFP/MS2和pEGFP/C1-G3BP共转染入Hela细胞。荧光显微成像结果显示, AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆, 而且在亚砷酸盐刺激下, 红色荧光标记的AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP-GFP共定位的颗粒。该结果表明, 针对AGTR1-3′UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功, 该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号。在细胞受到氧化应激时, AGTR1-3′UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中, 启示了AGTR1-3′UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用。