创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与细胞毒活性鉴定

摘要 : 研究重组创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， human ECV304)凋亡的作用。诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白， 应用Ni²⁺亲和层析方法对rVvhA进行纯化; 利用分步稀释加透析相结合的方法进行蛋白质复性; 绵羊红细胞裂解试验对复性后的rVvhA进行溶血活性初步测定; MTT法检测rVvhA对人ECV304细胞的体外毒性作用; 应用Hochest33342/PI活细胞荧光双染及流式细胞术分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响。结果显示， 用Ni²⁺-NTA His Band亲和层析柱纯化rVvhA纯度达88.6%左右; 复性后的rVvhA有一定的溶血活性， 其溶血活性具有时间-剂量依赖性; MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性; 浓度为2.0 HU/ml rVvhA作用人ECV304 12 h后， 其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5 HU/ml rVvhA处理组，具有剂量依赖性; 浓度为2.0 HU/ml rVvhA处理组加用40 μmol/L caspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0 HU/ml rVvhA处理组有一定程度降低。rVvhA对人ECV304细胞具有诱导凋亡的生物学活性， 推测诱导调亡途径可能与caspase家族有关。