A1 区替换提高人BDD-FVIII 重链的分泌并缓解其与轻链共转基因细胞链分泌的不均衡性

摘要 : 双载体转凝血VIII 因子基因(FVIII)可有效克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制， 但FVIII 重链分泌的低效性导致重、轻链分泌的不均衡。重链分泌的低效性源自其A1区存在与内质网蛋白质分子伴侣结合的位点。本文在我们最近运用蛋白质剪接的双载体共转B 区缺失型FVIII(BDD-FVIII)重链和轻链基因研究的基础上， 将重链的A1区替换为猪FVIII的A1区， 用融合蛋白内含子的重链和轻链转基因实验， 定量分析了重链的分泌及其对共转重链和轻链基因细胞分泌剪接BDD-FVIII 蛋白和活性的影响。结果显示， 变构体重链单独转基因时其分泌得到明显改善， 达到89±12 ng/ml， 明显高于人BDD-FVIII 重链的分泌(25±9 ng/ml); 该变构体重链与轻链共转基因细胞分泌的剪接变构体BDD-FVIII 和活性分别为219±51 ng/ml 和1.47±0.22 U/ml， 明显高于剪接的人BDD-FVIII 的分泌量和活性(116±32 ng/ml 和0.8±0.11 U/ml)。单独变构体重链和轻链转基因细胞合并培养后， 其培养上清中检测到剪接的变构体BDD-FVIII 和活性， 分别为38±7 ng/ml 和0.22±0.05 U/ml， 提示为不依赖细胞机制的蛋白质剪接所产生。结果表明， A1 区替换后重链分泌的增强，可促进基于蛋白质剪接技术的双载体共转重链和轻链基因细胞分泌的剪接BDD-FVIII水平和活性，并可缓解链分泌的不均衡性， 为动物体内应用双AAV载体共转BDD-FVIII重链和轻链基因研究奠定了实验基础。

CSTR: 32200.14.cjcb.2010.06.0007