利用双同源重组谱系示踪技术揭示肺损后肺泡干细胞再生起源

刘扩 孟鑫凤 周斌*
(多细胞体系结构与功能重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)

利用双同源重组谱系示踪技术揭示肺损后肺泡干细胞再生起源

刘扩 孟鑫凤 周斌*

(多细胞体系结构与功能重点实验室, 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院大学, 上海 200031)

【摘要】肺脏修复再生是肺领域研究热点。在一些肺脏疾病中肺泡上皮结构受损, 需要肺泡上皮干细胞的参与才能完成修复。因此揭示肺泡上皮干细胞的再生起源对肺脏疾病的防治具有重 要临床意义。领域内既往研究一致认为肺泡II型上皮细胞(AT2细胞)属于肺泡上皮干细胞, 不仅可 以自我增殖还可以分化为AT1细胞。近年来有研究认为AT2还可以来源于支气管棒状细胞(club细 胞)以及AT1细胞。然而这些研究中用来标记club细胞和AT1细胞的传统谱系示踪工具存在非特异 性标记问题, 导致这些结论存在重大科学争议。为阐明科学争议, 该团队通过构建一系列更为精准 的双同源重组谱系示踪新技术实现了对肺上皮细胞类型的特异性遗传靶向, 并结合多种肺脏损伤 模型揭示了新生AT2细胞除来源于AT2细胞自我增殖外, 还可来源于club细胞、支气管肺泡干细胞 (BASCs), 而不会来源于AT1细胞, 并阐明Notch信号通路参与调控club细胞和BASCs向AT2细胞命 运转分化。阐明AT2细胞再生起源为肺部疾病研究提供重要研究基础, 新开发的双同源重组谱系 示踪技术可被广泛应用于为发育生物学、遗传学和再生医学相关研究。

【关键词】肺脏再生; 细胞遗传谱系示踪; 肺泡干细胞; Notch信号通路; Cre-loxP; Dre-rox

Dual Recombinases-Mediated Genetic Tracing Reveals the Cellular Origin of Alveolar Stem Cells after Lung Injury

LIU Kuo, MENG Xinfeng, ZHOU Bin*

(State Key Laboratory of Cell Biology, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)

【Abstract】 Lung repair and regeneration have emerged as a pivotal area of research in pulmonology. In some lung diseases, the alveolar epithelial structure is damaged and requires the involvement of alveolar stem cells to regenerate the damaged areas. Consequently, elucidating the origins of alveolar stem cells holds immense clinical importance for the prevention and treatment of lung diseases. Previous studies have consistently identified AT2 cells (alveolar epithelial type II cells) as alveolar stem cells, capable of self-renewal and differentiation into AT1 cells. Nevertheless, recent investigations have proposed an alternative hypothesis, suggesting that AT2 cells can also originate from bronchiolar club cells and alveolar AT1 cells. However, the conventional lineage tracing techniques employed in these studies have been plagued with non-specific labeling issues, resulting in inconclusive findings. To address this controversy, This team has developed a suite of more precise dual recombinases-mediated genetic tools for the specific labeling of lung epithelial cell types. By integrating these tools with multiple lung injury models, this article has uncovered that new AT2 cells can originate from club cells and BASCs (bronchoalveolar stem cells), in addition to the self-renewal of AT2 cells, but not from AT1 cells. Furthermore, the study has revealed that the Notch signaling pathway plays a crucial role in regulating the transition of club cells and BASCs into AT2 cells. Elucidating the origins of AT2 cells during lung repair provides novel insights for the treatment of lung diseases. The dual recombination lineage tracing technique established in this article holds vast potential for broader applications in the fields of developmental biology, genetics, and regenerative medicine.

【Keywords】lung regeneration; cell genetic lineage tracing; alveolar stem cell, Notch signaling pathway; Cre-loxP; Dre-rox

1 细胞遗传谱系示踪技术

细胞遗传谱系示踪(genetic lineage tracing)技 术被广泛应用于发育生物学、遗传学、再生医学 等领域研究。细胞谱系示踪主要基于同源重组酶 系统, 目前已有多种同源重组酶系统被发现, 例如 Cre-loxP、Dre-rox、Flp-frt、Nigri-nox等[1]。它们 的工作原理类似, Cre-loxP系统最为广泛使用。以a-Cre;Rosa26-loxP-stop-loxP-GFP遗传工具为例介绍 其工作原理(图1A)。Cre为同源重组酶, 受细胞基因 启动子a驱动表达, loxP为Cre的识别位点, Cre可识 别并介导两个同向loxP位点之间发生同源重组, 并 切除loxP之间的基因序列。loxP-stop-loxP-GFP序列被插在管家基因Rosa26位点, 当细胞核内无Cre存 在时, 转录终止stop序列就会阻止基因转录, 后侧的 荧光报告基因不会表达。当启动子a被激活后 Cre 重组酶会表达并入核介导Cre-loxP重组, 切除stop序 列, 进而激活绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达。由于这种切割是发生在基因组水平, 无论细胞发生增殖或分化, a+ 或Cre+ 细胞都会被永久 性标记为GFP, 以此实现对靶细胞的谱系追踪(图1A 和图1B)[2]。

传统遗传谱系示踪技术主要依赖于一种同源 重组酶系统, 因此对靶细胞标记的特异性就取决于 启动子表达的细胞特异性。如果启动子a特异性表 达在A细胞, 那么通过谱系示踪实验我们可以明确 得出结论: A细胞可以转分化为B细胞。如果启动子 a除了表达在A细胞还“非特异性”表达在B细胞, 那 么我们无法准确区分B细胞是起源于A细胞还是起 源于起始标记的B细胞。因此这种非特异性标记问 题很容易导致谱系示踪假阳性结论(图1C)[2]。

我们研究团队长期致力于更为精准的谱系示 踪新技术开发。若一种同源重组酶Cre-loxP无法实 现对靶细胞的特异性标记, 那我们引入另一种同源 重组酶系统Dre-rox, 通过构建双同源重组谱系示踪 技术来实现对靶细胞特异性标记, 以此规避传统技 术的非特异性标记问题。利用双同源重组谱系示踪 技术我们已经解决包括心血管领域、肝脏再生及肺 脏再生等领域多个重大科学争议, 有力地推动了学科发展[3-8]。接下来我们将以揭示肺泡上皮干细胞再 生起源研究为例[5], 详细介绍双同源重组新技术的 选择与应用, 以期为领域内相关研究提供技术指导。

A: 细胞遗传谱系示踪技术原理, 当发生Cre-loxP重组后细胞A被标记为GFP。B: 通过谱系示踪可以监测到细胞A分化为细胞B。C: 若细胞A特 异性表达启动子a, 那么通过谱系示踪可以得出细胞B来源于细胞A的结论, 若启动子少量表达在细胞B, 那么无法得出细胞B来源于细胞A的结论。

A: a schematic diagram showing the cell principle of genetic lineage tracing. After Cre-loxP recombination, cell A is labeled by GFP. B: the differentiation of cell A into cell B can be monitored by genetic lineage tracing. C: if promoter a is specifically expressed in cell A, it can be concluded that cell B is derived from cell A. But if promoter a is non-specifically expressed in cell A, it cannot be concluded that cell B is derived from cell A.

图1 Cre-loxP系统介导的细胞遗传谱系示踪技术(根据参考文献[2]修改)

 Fig.1 Cre-loxP-mediated genetic lineage tracing (modified from reference [2])

2 肺脏上皮结构和功能

肺脏作为多功能器官, 对维持人体正常生理功 能至关重要。肺脏结构复杂, 从组织解剖位置上自 近端至远端可划分为气道、支气管和肺泡结构 [9]。 这些结构组成一个层级分支的树状结构, 共同负责 空气的传输和气体交换。在这些不同结构区域分布 着不同数目和类型的上皮细胞, 并且各自区域含有上 皮干细胞或祖细胞, 共同维持着上皮结构的稳定[9-10]。 小鼠肺脏结构与人类相似, 是进行肺脏研究的理想 模型。以小鼠为例, 气道上皮为假复层上皮, 主要 由基底细胞(basal cell)、棒状细胞(club cell)、纤毛 细胞(ciliated cell)和神经内分泌细胞(neuroendocrine cell)等细胞类型构成。club细胞可以分泌黏液不仅 具有排毒作用, 还可以维持呼吸道湿润, 减少外界刺 激和损伤。纤毛细胞可以通过摆动利用纤毛结构清 除黏附在气道表面的细菌、病毒、尘埃等异物, 从 而维持呼吸道清洁。神经内分泌细胞可以通过分泌 各种神经递质、神经肽等物质响应环境刺激例如机 械刺激、氧气浓度和过敏原等。其中基底细胞作为 气道上皮主要干细胞, 在稳态和气道受损后不仅可 以自我增殖还可以分化为棒状细胞和纤毛细胞等功 能细胞来维持上皮层稳定。有研究发现, 当利用白 喉毒素将气道基底细胞清除后, club细胞可以作为 干细胞转分化基底细胞, 进而再分化为其他功能性 细胞来修复上皮结构[11]。这项研究指出当亲本细胞 (parent cell)缺失时, 它的子代细胞(daughter cell)可以通过逆向去分化转变为亲本细胞类型去发挥干细 胞职能[11]。支气管上皮主要由club细胞、纤毛细胞 和神经内分泌细胞构成。其中club细胞是支气管上 皮主要干细胞, 当支气管损伤后其可以自我增殖并 分化为纤毛细胞促进再生修复[12]。神经内分泌细胞 数目少, 虽然在肺稳态不会发生分化, 但在支气管损 伤后也可以分化为club细胞和纤毛细胞从而参与上 皮修复[13-14]。纤毛细胞属于终末分化细胞, 不会发 生细胞命运转变, 因此其更新主要依赖于基底细胞、 club细胞或神经内分泌细胞分化[15]。

肺泡上皮是气体交换的主要场所, 主要由I型肺 泡上皮细胞(alveolar type I cell, AT1 cell)和II型肺泡 上皮细胞(alveolar type II cell, AT2 cell)构成。AT1细 胞形态呈扁平状, 占肺泡表面积的95%, 主要负责气 体交换。AT2细胞形态呈立方形或圆形, 占肺泡表 面积的5%, 可以通过分泌表面活性物质降低肺泡表 面张力、防止肺泡塌缩[16]。AT2细胞属于肺泡干细胞, 当肺泡受损后, 可以增殖并分化为AT1细胞, 从而参 与肺泡的修复再生[17-19]。

3 肺泡干细胞再生起源研究进展

在一些肺部疾病, 例如特发性肺纤维化、肺炎、 慢性阻塞性肺病、肺气肿等肺病中, AT2肺泡干细 胞会持续受损, 导致肺部损伤修复障碍[10]。因此增 强AT2细胞生存能力、寻找AT2细胞再生起源对恢 复肺部功能结构具有重要意义。对于AT2细胞再生 起源研究, 之前领域内认为AT2细胞主要来源于肺 泡原位AT2干细胞的自我增殖[17]。有研究进一步发 现AT2细胞群存在异质性, 其中有一亚群表达Axin2, 并揭示Axin2+ AT2细胞属于AT2干细胞, 在肺损伤 (高氧损伤模型和流感损伤模型)后可以再生AT2细 胞和AT1细胞进而参与肺泡上皮损伤修复[18-19]。近 年来, 关于AT2细胞再生起源陆续有新的观点被提 出。有研究发现在支气管末端存在一群p63+ Krt5+ 干细胞, 称为支气管末端干细胞(distal airway stem cells, DASC)[20]。DASC在流感损伤模型中会迁移至 肺泡区域并分化为AT1细胞和AT2细胞促进肺泡再 生修复[20]。也有研究认为在稳态支气管末端存在一 小群干细胞, 称为谱系阴性干细胞(lineage-negative epithelial stem/progenitors, LNEPs)。在一些肺脏 损伤模型 (例如流感模型和博来霉素诱导模型 )中 LNEPs会表达p63和Krt5, 并且会迁移至肺泡区域分化为成熟肺泡上皮细胞类型。这个过程需要Notch 信号通路参与, 当Notch通路被抑制后会促进LNEPs 分化为AT2细胞[21-22]。另外, 有研究提出在支气管和 肺泡交界位置存在一群肺上皮干细胞, 称为支气管 肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells, BASCs), 具 有同时表达club细胞分子标记Scgb1a1和AT2细胞 分子标记Sftpc的特点[23]。前人研究BASCs主要利 用细胞分选和体外培养方式, 其在体内是否真实存 在缺乏严格遗传学证据证明 [23]。利用双同源重组 谱系示踪技术, 我们团队[6,24]以及其他团队[25]先后证 明BASCs属于肺脏多潜能干细胞, 当支气管损伤后 BASCs会分化为club细胞和纤毛细胞促进支气管上 皮修复, 当肺泡损伤后BASCs又可以分化为AT2细 胞和AT1细胞促进肺泡上皮再生修复。利用单细胞 克隆分析技术, 我们也发现当给与支气管和肺泡两 种损伤后, 单个BASC具有向支气管和肺泡双向分化 潜能, 可以同时分化为club细胞、纤毛细胞、AT2细 胞和AT1细胞促进支气管和肺泡再生修复[24]。

关于肺损后AT2细胞的再生来源一直属于领域 内研究热点。最近有国际权威期刊提出了全新的概 念, 认为AT1细胞和club细胞也可以通过转分化AT2细 胞促进肺再生[26-29,31-33]。首先对于AT1细胞, PSTEIN团 队[26]首先报道AT1细胞在肺切模型中可以转分化AT2 细胞从而促进肺泡再生。随后, MORRISEY团队[27-28] 先后报道在高氧损伤模型及左肺结扎诱导的肺泡 张力缺失模型中同样可以观测到AT1细胞转分化为 AT2细胞。细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, CDC42)蛋白在依赖于肌动蛋白细胞骨架的细胞 过程中发挥重要作用, 例如细胞迁移、细胞极性和 细胞命运决定等。蛋白酪氨酸激酶2(protein tyrosine kinase 2, PTK2)在介导细胞接触、细胞迁移方面同 样发挥重要调控作用。MORRISEY团队[28]进一步发 现, 在AT1细胞中敲除Cdc42或Ptk2基因后会导致细 胞机械应力减小, 直接促使AT1细胞转分化为AT2细 胞。Krüppel样因子5(Kruppel-like factor 5, KLF5)属 于一种锌指转录调节因子, MORRISEY团队[29]同样 发现在AT1细胞中敲除Klf5基因后也会诱导AT1细胞 转分化为AT2细胞。对于肺癌起源, 以往研究发现 在支气管club细胞和肺泡AT2细胞中过表达致癌基 因KrasG12D均可以诱导其恶性扩增并发展为肺癌[30]。 近期DESAI团队[31]在Nature期刊报道当在AT1细胞 中过表达KrasG12D也可诱导其重编程为AT2干细胞,这项研究提出 AT1细胞是一种新的肺腺癌细胞起 源。对于club细胞, CHAPMAN团队[32]通过类器官 培养和细胞移植等技术发现club细胞存在一个H2- K1high干细胞亚群, 可以在肺损伤后分化为AT2细胞 促进肺泡修复再生。LEE团队[33]进一步通过体内谱 系示踪实验报道在博来霉素诱导的肺损伤模型中 , club细胞会迁移至肺泡区域分化为AT2细胞促进肺 泡再生。以上这些报道均属于肺脏干细胞研究突破 性发现, 极大地推进了肺脏再生领域研究发展。然 而, 这些研究中用来标记AT1细胞的遗传工具HopxCreER和club细胞遗传工具Scgb1a1-CreER的特异性 未被严格评估, 利用其所得出的实验结论存在质疑。 然而, 我们前期研究发现这些遗传工具具有非特异 性标记问题[5], 说明AT2细胞是否能来源于AT1细胞 或club细胞确实存在科学争议, 领域内亟需构建更 为精准的谱系示踪新技术对这些争议进行阐明。

4 肺损后AT1细胞不会转分化为AT2细胞

为了阐明AT2细胞是否可以来源于AT1细胞或 club细胞, 我们首先对领域内普遍使用的AT1细胞标 记工具Hopx-CreER, 进行了系统性鉴定[26-29,31]。对稳 态下成体Hopx-CreER;R26-tdT工具小鼠进行肺脏切 片及免疫荧光染色分析, 发现其除了标记AT1细胞外, 还“非特异”标记约66% club细胞、约92% ciliated细 胞、约12% BASCs和约0.24% AT2细胞。由于之前研 究已经提出BASCs、club细胞和AT2细胞在肺脏损后 可以贡献给AT2细胞, 因此这些“非特异性”标记细胞 会对Hopx-CreER;R26-tdT的谱系示踪结果产生很大干 扰[5]。同时我们也构建了Hopx-2A-DreER工具小鼠, 也 验证在Hopx-2A-DreER;R26-RSR-tdT小鼠中同样发现 非特异性标记问题。tdT除了标记AT1细胞外, 还“非 特异”标记club细胞、ciliated细胞和少部分BASCs[5]。 另外, 我们也发现领域内另一种AT1遗传工具AgerCreER除了标记AT1细胞也会“非特异性”标记一部分 AT2细胞和少量BASCs[34]。通过这些实验, 我们揭示 基于Hopx基因或Ager基因的传统单同源重组酶驱动 的谱系示踪技术具有非特异性标记问题, 因此无法利 用其对AT1细胞进行严格的谱系示踪研究。亟需构建 谱系示踪新技术对其AT1细胞可塑性重新进行研究。

通过对比, 我们发现Hopx-2A-DreER与AgerCreER非特异性标记的细胞类型具有“互斥”特点, 即Hopx-2A-DreER“非特异性”标记细胞类型主要是ciliated细胞和club细胞, 而Ager-CreER“非特异性”细 胞类型主要是AT2细胞和BASCs。因此, 我们提出 是否可以利用双同源重组酶驱动的谱系示踪新技 术来解决此难题。基于这个“互斥”特点, 我们首先 利用交叉标记策略(intersectional strategy)[6]尝试对 Hopx+ Ager+ AT1细胞进行特异性标记(图2A)。这个 交叉标记策略的双同源重组报告系统序列结构是 Rosa26-rox-stop-rox-loxP-stop-loxP-tdTomato(简称 为R26-RSR-LSL-tdT)。在这个系统中, 只有细胞中同 时发生Dre-rox和Cre-loxP重组, 后面的报告基因tdT 才会表达(图2A)。通过小鼠配繁我们获得Hopx-2ADreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT三基因型小鼠, 注射他莫昔芬后收取肺脏样本进行体内验证, 成功 证明其可实现对约80% Hopx+ Ager+ AT1细胞特异性 标记(图2B~图2D)。然而, 结合多种肺损伤模型(肺 切、博来霉素和高氧损伤模型), 我们并未检测到肺 损后AT1细胞转分化为AT2细胞(图2E~图2G)。

上述策略只是标记Hopx+ Ager+ AT1细胞亚群, 为了更高效率地标记所有AT1细胞, 我们尝试利用 嵌套策略(nested strategy)来对AT1细胞进行研究[3]。 这个嵌套策略双报告系统序列结构是Rosa26-loxProx-stop-rox-ZsGreen-stop-loxP-tdTomato(简称为 R26-NR2)。在这个系统中, rox识别位点位于内侧, loxP识别位点位于rox-stop-rox-ZsGreen外侧, 当细 胞内发生Dre-rox重组后该细胞会被标记为ZsGreen, 当再次发生Cre-loxP重组后ZsGreen和stop序列均会 被切除, 细胞最终被标记为tdTomato(图3A)。我们 前期实验已经证明Hopx-2A-DreER除了标记AT1细 胞外, 还“非特异”标记club细胞、ciliated细胞、少 部分AT2细胞和BASCs。而Sox2-CreER工具可以 标记club细胞和ciliated细胞, Sftpc-CreER工具可以 标记AT2细胞和BASCs, 因此为“封闭”这些“非特异 性”标记细胞类型, 我们构建了双同源重组“嵌套策 略”遗传工具: Hopx-2A-DreER;Sox2-CreER;SftpcCreER;R26-NR2四基因型工具小鼠。在此策略中, Hopx+ AT1细胞发生Dre-rox重组后会被特异性标记 为ZsGreen, 而在“非特异”标记的club细胞、ciliated 细胞、BASCs及AT2细胞中由于再次发生Cre-loxP 重组均会被统一标记为tdTomato(图3B)。通过验证, 我们发现这一策略是可行的, 可以高效、特异性标 记约98% AT1细胞, 而AT2细胞、club细胞、ciliated 细胞和BASCs均被标记为tdTomato(图3C和图3D)。然而结合多种肺损伤(肺切损伤和博来霉素损伤)模 型, 我们仍然未检测到新生AT2细胞来源于AT1细胞 (图3E~图3G)。近期也有研究团队发现Hopx+ Igfbp2+ AT1细胞在肺切损伤模型中不会转分化为AT2细胞, 我们的研究结论也与该报道一致[35]。因此, 通过构 建两种双同源重组谱系示踪新技术, 我们揭示AT1 细胞不具备可塑性, 在肺损伤修复中不会转分化为 AT2细胞, 解决了这一重要科学争议。

A: 利用交叉标记策略对Hopx+ Ager+ AT1细胞进行特异性标记。B: Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT小鼠他莫昔芬诱导后收取肺脏 切片进行免疫荧光共染tdT、AGER或Scgb1a1。C: 统计tdT标记的肺上皮细胞类型。D: 卡通图表示利用交叉策略实现对AT1细胞特异性标记。E: 对Hopx-2A-DreER;R26-RSR-tdT对照组小鼠和Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT实验组小鼠进行博来霉素损伤。4周后, 收取肺脏样 本进行tdT和Sftpc免疫荧光染色。F: 统计tdT标记的AT2细胞比例。****P<0.000 1。G:卡通示意图展示AT1细胞不会转分化为AT2细胞。 

A: a schematic diagram showing the intersectional genetic strategy for lineage tracing of Hopx+ Ager+ AT1 cells. B: immunostaining of tdT, AGER, and Scgb1a1 on lung sections of Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT mice after tamoxifen treatment. C: quantification of the percentage of pulmonary epithelial cells that are labeled by tdT. D: schematic diagram illustrating the AT1 cells are specifically labeled by intersectional genetic strategy. E: immunostaining of tdT and Sftpc on lung sections of Hopx-2A-DreER;R26-RSR-tdT mice and Hopx-2A-DreER;Ager-CreER;R26-RSR-LSL-tdT mice after bleomycin injury. F: quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT. ****P<0.000 1. G: AT1 cells do not differentiate into AT2 cells after bleomycin injury.

图2 利用交叉标记策略揭示肺损后AT1细胞不会转变为AT2细胞(根据参考文献[5]修改) 

Fig.2 Intersectional genetics reveal that AT1 cells do not generate AT2 cells after lung injuries (modified from reference [5])

5 肺损后club细胞参与肺泡上皮再生修复

针对领域内普遍使用的 club细胞遗传工具 Scgb1a1-CreER[12], 我们同样进行了系统验证。通过验 证, 我们发现Scgb1a1-CreER;R26-tdT工具同样具有非 特异性标记问题, 其除了标记club细胞外还会“非特异 性”标记BASCs和少量AT2细胞, 这会对club细胞的谱 系示踪结果产生干扰。因此我们基于Cre-loxP和Drerox构建了另一种双同源重组报告系统, 结构为Rosa26- rox-stop-rox-ZsGreen-loxP-stop-loxP-tdTomato(简称为 R26-TLR) [36]。在此系统中, 当细胞内发生Cre-loxP重 组, 该细胞会被标记为tdTomato, 当细胞内发生Dre-rox 重组, 该细胞会被标记为ZsGreen, 当细胞内同时发生 Cre-loxP和Dre-rox重组, 该细胞会被标记为tdTomato和 ZsGreen, 从而展现出黄色荧光标记(图4A)。因此利用 此原理, 我们构建了Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26- TLR三基因型工具小鼠。通过体内验证, 我们证实club 细胞、BASCs和AT2细胞分别被特异性标记为tdTomato+ 、tdTomato+ ZsGreen+ 和ZsGreen+ , 分别称之为Clubtracer、BASC-tracer和AT2-tracer。以此解决了传统技术 的非特异性标记问题(图4B和图4C)。

结合多种肺损伤模型, 我们发现这三种细胞群 对肺泡再生的贡献程度根据肺肺泡损伤的程度不同 表现出显著性差异。在肺切损伤模型中, AT2细胞主 要依赖于自我更新, club细胞和BASCs的贡献非常 少, 两者贡献加起来低于2%。在博来霉素诱导的肺 损伤模型中, 新生AT2细胞除自我更新外还来源于 club细胞(约27%)和BASCs(约11%)(图4D和图4E)。

为进一步挖掘club细胞对肺泡上皮修复的潜力, 我们改进了双同源重组报告系统, 在rox-stop-rox序列后额外插入了p21基因序列, 可以在Dre-rox重组 后同时诱导细胞过表达p21蛋白(图5A)。p21蛋白是 细胞周期抑制因子, 我们前期研究发现细胞过表达 p21蛋白可抑制细胞增殖[37]。为封闭BASCs和AT2 细胞的增殖能力, 使之不能参与再生修复, 以此激发 club细胞的可塑性潜力, 我们最终构建了双同源重 组系统, 即Sftpc-DreER;R26-rox-p21-GFP;Scgb1a1- CreER;R26-LZL-tdT四基因型遗传工具。在这个系 统内, club细胞内会发生Cre-loxP被标记为tdTomato, AT2细胞内会发生Dre-rox重组被标记为GFP并表达 p21蛋白, BASCs内同时发生Cre-loxP和Dre-rox重组 会被标记为tdTomato和GFP并表达p21蛋白(图5B)。 通过体内验证, 我们证明此策略是可行的。因此, 再 结合博来霉素损伤模型, 我们尝试挖掘club细胞的 可塑性潜能。收取博来霉素损伤4周后的肺脏进行 分析, 发现AT2细胞和BASCs原本的修复能力成功 被抑制, 并发现club细胞大量转分化为新生AT2细胞 和AT1细胞, 统计显示损伤区域约47% AT2细胞起源 于club细胞(图5C)。进一步, 收取损伤后8个月修复 的肺脏进行分析, 我们惊奇地发现约82% AT2细胞 起源于club细胞(图5C和图5D)。我们发现某些损伤 严重的肺叶中, club细胞来源的肺泡上皮细胞可以 覆盖绝大部分肺泡区域。通过以上实验, 我们揭示 当AT2细胞和BASCs修复能力被抑制时, club细胞会 成为新生AT2细胞主要来源, 参与肺泡上皮再生修 复。通过以上多种双同源重组谱系示踪新技术, 我 们阐明club细胞可作为干细胞参与肺泡上皮再生修 复, 解决了这一重要科学争议。

A、B: 利用嵌套标记策略对AT1细胞进行特异性标记。C: 对Hopx-2A-DreER;R26-NR2小鼠和Hopx-2A-DreER;Sox2-CreER;Sftpc-CreER;R26-NR2 小鼠肺脏切片进行ZsG和tdT免疫荧光染色。D: 卡通图表示利用嵌套策略实现对AT1细胞特异性标记。E: 对小鼠进行博来霉素损伤4周后收 取肺脏样本进行tdT和Sftpc免疫荧光染色。F: 统计tdT和ZsG标记的AT2细胞比例。****P<0.000 1。G: 卡通示意图展示AT1细胞不会转分化为 AT2细胞。 

A,B: a schematic diagram showing the nested genetic strategy for lineage tracing of AT1 cells. C: immunostaining of tdT and ZsG on lung sections of Hopx-2A-DreER;R26-NR2 mice and Hopx-2A-DreER;Sox2-CreER;Sftpc-CreER;R26-NR2 mice after tamoxifen treatment. D: schematic diagram illustrating the AT1 cells are specifically labeled by ZsG and the non-AT1 cells are labeled by tdT with nested genetic strategy. E: immunostaining of tdT, ZsG, and Sftpc on lung sections after bleomycin injury. F: quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG. ****P<0.000 1. G: AT1 cells do not generate AT2 cells after bleomycin injury.

图3 肺损后AT2细胞不会来源于AT1细胞(根据参考文献[5]修改)

Fig.3 AT1 cells do not generate AT2 cells after lung injury (modified from reference [5])

6 Notch信号通路参与club细胞和BASCs 向AT2细胞转分化

利用谱系示踪新技术 , 我们揭示 club细胞和BASCs在博来霉素诱导的肺损伤模型中可以迁移至 肺泡区域, 并分化为肺泡上皮细胞促进肺泡再生修 复。那么在分子机制上, 是何种信号通路调控club 细胞及BASCs向AT2细胞发生细胞命运转变呢？这 两种分子调控机制之间又有什么区别？为了进一 步探究这一科学问题, 我们对Scgb1a1-CreER;SftpcDreER;R26-TLR工具小鼠进行博来霉素损伤, 修复 4周后并分选Club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer 标记细胞进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)分析。 分析显示Club-tracer标记的细胞可以被划分为多个 细胞亚群(cell cluster), 包括起始标记的club细胞亚 群, 还有细胞分化终点的AT2细细胞、AT1细胞亚群, 以及多种中间态细胞亚群。这些细胞亚群具有不同 的基因表达特点, 拟时序分析揭示这些细胞亚群之 间具有紧密的谱系联系, 细胞命运转变路径从club 细胞亚群经中间态细胞分化为AT2细胞和AT1细胞。 另外, 根据基因表达BASC-tracer标记的细胞也可被 划分为多个细胞亚群, 包括起始标记的BASC亚群, 还有细胞分化后的AT2细细胞、AT1细胞亚群, 以及 中间态细胞亚群。这些细胞亚群在基因表达谱系上 同样具有连贯性, 拟时序分析显示细胞分化谱系起 始于BASC-细胞, 然后经过中间态细胞可依次分化 为AT2细胞和AT1细胞。进一步通过与Club-tracer对 比, 我们发现BASC-tracer中的AT2细胞在基因表达 上更接近于AT2-tracer中的AT2细胞。因为BASC的 特征之一是同时表达club细胞和AT2细胞分子标记, 我们前期研究也揭示BASC的基因表达位于club细 胞和AT2细胞之间, 这暗示BASC可能会更快地响应损伤并转分化为更加成熟的AT2细胞。

通过进一步生信分析, 我们发现在club细胞及 BASCs向AT2细胞转分化过程中Notch信号通路表 现下调趋势, 暗示Notch信号通路可能参与这两种细 胞命运转变。我们构建的双同源重组谱系示踪新 技术不仅可应用于细胞特异性遗传标记, 还可以结 合条件性基因敲除技术进行细胞特异性基因敲除。 RBPJ是Notch信号通路关键核转录因子, 敲除Rbpj 可抑制Notch信号通路转导。因此, 为了进一步验证 Notch信号通路在体内的调控作用, 我们结合Rbpjflox/ flox条件性敲除小鼠, 构建了Scgb1a1-CreER;SftpcDreER;R26-TLR;Rbpjflox/flox工具小鼠, 可实现在体内 示踪club-tracer、BASC-tracer和AT2-tracer的同时 实现在club细胞和BASCs中特异性敲除Notch信号 通路(对照组小鼠基因型为: Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR;Rbpjflox/+ )(图6A和图6B)。对以上小 鼠进行博来霉素损伤, 4周后收取肺脏组织进行切片 免疫荧光分析及流式细胞分析, 我们发现与对照组 相比, Notch信号通路敲除后会显著性抑制club细胞 向AT2细胞转变, 反而会促进BASCs向AT2细胞转变 (图6C)。我们的研究证实在肺损后club细胞可作为 干细胞来源补充受损的AT2细胞, 并且首次在功能 层面上揭示club细胞与BASCs属于两种不同细胞类 型, 不仅具有不同基因表达特点, 而且在向AT2细胞 转分化过程中受Notch信号通路相反的调控(图6D)。

A、B: 利用双同源重组谱系示踪同时对club细胞、BASCs和AT2细胞进行特异性标记。C: 对Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR小鼠肺脏 切片进行ZsG、tdT、Scgb1a1或Sftpc免疫荧光染色。D: 对小鼠进行博来霉素损伤后的肺脏样本进行tdT和Sftpc免疫荧光染色及统计分析。 ***P<0.001, ****P<0.000 1。E: 卡通示意图展示肺泡损伤后club细胞和BASCs会迁移至肺泡区域分化为AT2和AT1细胞促进肺泡修复再生。 

A,B: schematic diagrams showing intersectional genetics for simultaneous and specific labeling of club cells, BASCs, and AT2 cells. C: immunostaining of tdT, ZsG, Scgb1a1, and Sftpc on lung sections of Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR mice after tamoxifen treatment. D: immunostaining of tdT, ZsG, and Sftpc on lung sections after bleomycin injury and quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG. ***P<0.001, ****P<0.000 1. E: cartoon image showing club cells and BASCs give rise to AT2 cells and AT1 cells after bleomycin injury.

图4 club细胞参与肺泡再生修复(根据参考文献[5]修改) 

Fig.4 club cells contribute to alveolar epithelial cells during lung repair (modified from reference [5])

A、B: 利用双同源重组谱系示踪同时对club细胞、BASCs和AT2细胞进行特异性标记并在club细胞和BASCs中过表达p21蛋白。C、D: 对SftpcDreER;R26-rox-p21-GFP;Scgb1a1-CreER;R26-LZL-tdT小鼠进行博来霉素损伤后4周和8个月的肺脏样本进行tdT和GFP免疫荧光染色及统计分 析。**P<0.01, ****P<0.000 1。 

A,B: schematic diagrams showing genetic labeling of club cells, BASCs, and AT2 cells and induce p21 expression in club cells and BASCs. C: immunostaining of tdT and ZsG on lung sections of Sftpc-DreER;R26-rox-p21-GFP;Scgb1a1-CreER;R26-LZL-tdT mice after 4 weeks and 8 months bleomycin injury. D: quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG at 8 months post bleomycin injury. **P<0.01, ****P<0.000 1.

图5 肺泡极端损伤下club细胞能再生大部分肺泡(根据参考文献[5]修改) 

Fig.5 Club cells regenerate the majority of alveolar epithelium after severe alveolar injury (modified from reference [5])

7 总结与展望

在器官发育与再生领域的研究主要包括体外 细胞实验与体内细胞谱系研究。由于体外环境不可 控, 无法准确模拟体内微环境, 因此将体外结论进行体内验证是一项重要且不可或缺的步骤。而对体内 进行细胞研究往往不可避免地会使用到细胞遗传谱 系示踪技术。我们已经指出传统遗传谱系示踪技 术具有细胞靶向精度低的问题, 其对靶细胞的“非特 异性”标记容易造成争议性结论。因此对遗传工具 进行特异性标记检验是开展谱系示踪研究的重要前 提。双同源重组谱系示踪新技术已被证明可以规避 传统技术“非特异性”标记问题, 并揭示或阐明多个 领域内重大科学争议, 彰显出新技术在谱系示踪领 域巨大的应用潜力。

由于传统技术的非特异性靶向缺陷, 导致领域 内关于肺泡干细胞再生来源一直存在科学争议。利 用更为精准的双同源重组谱系示踪新技术, 我们阐 明了科学争议, 揭示肺损后新生AT2细胞除了自我 更新外, 还可来源于club细胞和BASCs, 而不会来源 于AT1细胞, 并阐明参与其中的分子调控机制。阐 明肺泡干细胞再生来源不仅为临床肺脏疾病的诊治 提供了新的研究基础和突破口, 新开发的谱系示踪 新技术, 也为器官发育、再生医学及遗传学等研究 提供了新的技术方法。

A、B: 实验策略。对club细胞、BASCs和AT2细胞标记的同时在club细胞和BASCs中特异性敲除Notch信号通路。C: 取对小鼠进行博来霉素损 伤后4周的肺脏样本进行tdT和ZsG免疫荧光染色及统计分析。*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1。D: 卡通图展示肺泡损伤后, 新生AT2细胞 除了来源于AT2自我增殖外还来源于club细胞和BASCs, 而不会来源于AT1细胞。抑制Notch通路会减少club细胞向AT2细胞转分化, 而会促进 BASCs向AT2细胞转分化。 

A,B: schematic diagrams showing genetic labeling of club cells, BASCs, and AT2 cells and induce p21 expression in club cells and BASCs. C: immunostaining of tdT and ZsG on lung sections and quantification of the percentage of AT2 cells labeled by tdT or ZsG at 4 months post bleomycin injury. *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1. D: cartoon image showing after alveolar injury, the AT2 cells could originate from club cells and BASCs, but not from AT1 cells. Knock-out Notch signaling inhibits the transition of club cells into AT2 cells but promotes the transition of BASCs into AT2 cells.

图6 Notch信号通路在club细胞和BASCs向AT2细胞转分化中承担相反的调控作用(根据参考文献[5]修改) 

Fig.6 Notch signaling distinct regulates the cell fate conversion of club cells and BASCs into AT2 cells (modified from reference [5])

参考文献 (References)

[1] LIU K, JIN H, ZHOU B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: a user’s guide for conducting more precise cell fate mapping studies [J]. J Biol Chem, 2020, doi: 10.1074/ jbc.REV120.011631. 

[2] TIAN X, PU W T, ZHOU B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis [J]. Circ Res, 2015, 116(3): 515-30. 

[3] HE L J, LI Y, LI Y, et al. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases [J]. Nat Med, 2017, 23(12): 1488-98. 

[4] PU W, ZHU H, ZHANG M, et al. Bipotent transitional liver progenitor cells contribute to liver regeneration [J]. Nat Genet, 2023, 55(4): 651-64. 

[5] LIU K, MENG X, LIU Z, et al. Tracing the origin of alveolar stem cells in lung repair and regeneration [J]. Cell, 2024, doi: 10.1016/j.cell.2024.03.010. 

[6] LIU Q, LIU K, CUI G, et al. Lung regeneration by multipotent stem cells residing at the bronchioalveolar-duct junction [J]. Nat Genet, 2019, 51(4): 728-38. 

[7] LI Y, HE L, HUANG X, et al. Genetic lineage tracing of nonmyocyte population by dual recombinases [J]. Circulation, 2018, 138(8): 793-805. 

[8] LI Y, LÜ Z, HE L, et al. Genetic tracing identifies early segregation of the cardiomyocyte and nonmyocyte lineages [J]. Circ Res, 2019, 125(3): 343-55. 

[9] BASIL M C, KATZEN J, ENGLER A E, et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future [J]. Cell Stem Cell, 2020, 26(4): 482-502. 

[10] BASIL M C, ALYSANDRATOS K D, KOTTON D N, et al. Lung repair and regeneration: advanced models and insights into human disease [J]. Cell Stem Cell, 2024, 31(4): 439-54. 

[11] TATA P R, MOU H M, PARDO-SAGANTA A, et al. Dedifferentiation of committed epithelial cells into stem cells in vivo [J]. Nature, 2013, 503(7475): 218-23. 

[12] RAWLINS E L, OKUBO T, XUE Y, et al. The role of Scgb1a1+ Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar, epithelium [J]. Cell Stem Cell, 2009, 4(6): 525-34. 

[13] SONG H, YAO E, LIN C, et al. Functional characterization of pulmonary neuroendocrine cells in lung development, injury, and tumorigenesis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(43): 17531-6. 

[14] OUADAH Y, ROJAS E R, RIORDAN D P, et al. Rare pulmonary neuroendocrine cells are stem cells regulated by Rb, p53, and Notch [J]. Cell, 2019, 179(2): 403-16,e23. 

[15] RAWLINS E L, OSTROWSKI L E, RANDELL S H, et al. Lung development and repair: contribution of the ciliated lineage [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(2): 410-7. 

[16] HOGAN B L, BARKAUSKAS C E, CHAPMAN H A, et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function [J]. Cell Stem Cell, 2014, 15(2): 123-38. [17] BARKAUSKAS C E, CRONCE M J, RACKLEY C R, et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung [J]. J Clin Invest, 2013, 123(7): 3025-36. 

[18] NABHAN A N, BROWNFIELD D G, HARBURY P B, et al. Single-cell Wnt signaling niches maintain stemness of alveolar type 2 cells [J]. Science, 2018, 359(6380): 1118-23. 

[19] ZACHARIAS W J, FRANK D B, ZEPP J A, et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor [J]. Nature, 2018, 555(7695): 251-5. 

[20] ZUO W, ZHANG T, WU D Z, et al. p63+ Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration [J]. Nature, 2015, 517(7536): 616-20. 

[21] VAUGHAN A E, BRUMWELL A N, XI Y, et al. Lineagenegative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury [J]. Nature, 2015, 517(7536): 621-5. 

[22] XI Y, KIM T, BRUMWELL A N, et al. Local lung hypoxia determines epithelial fate decisions during alveolar regeneration [J]. Nat Cell Biol, 2017, 19(8): 904-14. 

[23] KIM C F, JACKSON E L, WOOLFENDEN A E, et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer [J]. Cell, 2005, 121(6): 823-35.

[24] LIU K, TANG M, LIU Q, et al. Bi-directional differentiation of single bronchioalveolar stem cells during lung repair [J]. Cell Discov, 2020, doi: 10.1038/s41421-019-0132-8. 

[25] SALWIG I, SPITZNAGEL B, VAZQUEZ-ARMENDARIZ A I, et al. Bronchioalveolar stem cells are a main source for regeneration of distal lung epithelia in vivo [J]. EMBO J, 2019, doi: 10.15252/embj.2019102099. 

[26] JAIN R, BARKAUSKAS C E, TAKEDA N, et al. Plasticity of Hopx+ type I alveolar cells to regenerate type II cells in the lung [J]. Nat Commun, 2015, doi: 10.1038/ncomms7727. 

[27] PENKALA I J, LIBERTI D C, PANKIN J, et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration [J]. Cell Stem Cell, 2021, 28(10):1775-89. 

[28] SHIRAISHI K, SHAH P P, MORLEY M P, et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate [J]. Cell, 2023, 186(7): 1478-92,e15. 

[29] LIBERTI D C, LIBERTI III W A, KREMP M M, et al. Klf5 defines alveolar epithelial type 1 cell lineage commitment during lung development and regeneration [J]. Dev Cell, 2022, 57(14): 1742-57,e5. 

[30] XU X, ROCK J R, LU Y, et al. Evidence for type II cells as cells of origin of K-Ras-induced distal lung adenocarcinoma [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(13): 4910-5. 

[31] JUUL N H, YOON J K, MARTINEZ M C, et al. KRAS(G12D) drives lepidic adenocarcinoma through stem-cell reprogramming [J]. Nature, 2023, 619(7971): 860-7. 

[32] KATHIRIYA J J, BRUMWELL A N, JACKSON J R, et al. Distinct airway epithelial stem cells hide among club cells but mobilize to promote alveolar regeneration [J]. Cell Stem Cell, 2020, 26(3): 346-58,e4. 

[33] CHOI J, JANG Y J, DABROWSKA C, et al. Release of Notch activity coordinated by IL-1beta signalling confers differentiation plasticity of airway progenitors via Fosl2 during alveolar regeneration [J]. Nat Cell Biol, 2021, 23(9): 953-66. 

[34] CHUNG M I, HOGAN B L M. Ager-CreER(T2): a new genetic tool for studying lung alveolar development, homeostasis, and repair [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2018, 59(6): 706-12. 

[35] WANG Y, TANG Z, HUANG H, et al. Pulmonary alveolar type I cell population consists of two distinct subtypes that differ in cell fate [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(10): 2407-12. 

[36] LIU K, TANG M, JIN H, et al. Triple-cell lineage tracing by a dual reporter on a single allele [J]. J Biol Chem, 2020, 295(3): 690-700. 

[37] PU W, HAN X, HE L, et al. A genetic system for tissue-specific inhibition of cell proliferation [J]. Development, 2020, doi: 10.1242/dev.183830.