重组激活基因1 shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

摘要 : 构建3对针对大鼠海马神经元重组激活基因(Rag1)的RNA干扰重组表达载体及1对无关序列的载体， 分别命名为shRNA1、shRNA2、 shRNA3及negative。经基因测序确认后， 采用慢病毒载体系统分别包装4个载体， 而后分别感染体外培养的大鼠原代海马神经细胞， 收集感染后96 h的细胞， 通过免疫荧光观察细胞感染情况， 并且利用RT-PCR和Western印迹检测Rag1 mRNA及蛋白质的表达。经测序鉴定合成的shRNA序列正确， 并且慢病毒感染细胞效果良好。LV-shRNA1组、LV-shRNA2组、LV-shRNA3组与正常对照组相比， Rag1 mRNA表达都明显减少(P<0.01)， 其中LV-shRNA3组的抑制效率最高为(76.4±3.5)%， Western印迹结果与其基本一致， 而LV-negative组对Rag1 mRNA及其表达的蛋白质都无明显影响。实验结果表明， 我们成功构建了能特异性抑制大鼠海马神经元Rag1表达的shRNA慢病毒表达载体。