LIPUS调控FOXO1磷酸化促进氧化损伤的人牙周膜干细胞成骨分化的作用研究

唐丽¹ 庞华² 杨珂3 王冬⁴ 姚欢¹*

( ¹重庆医科大学第附属第一医院, 超声科, 重庆 400016; ²重庆医科大学附属第一医院, 核医学科, 重庆 400016; ³重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所, 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心, 儿童发育与疾病教育部重点实验室, 中国儿童发育与危重症国际科技合作基地, 重庆市干细胞治疗工程技术研究中心, 重庆 400014; ⁴四川省医学院, 四川省人民医院(电子科技大学附属医院), 超声科, 成都 610072)

摘要 :

该研究探讨低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS)对氧化损伤的人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)成骨分化的保护作用及机制。采用浓度为300 µmol/L的H2O2构建细胞氧化损伤模型, 将其分为对照组、H2O2组、LIPUS组和LIPUS+H2O2组。DCFH-DA探针和TBA比色法分别检测各组细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平; 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和茜素红染色分别评估各组细胞早期及晚期成骨分化能力; WB(Western blot)评价抗氧化酶[过氧化氢酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2, SOD-2)]、成骨相关蛋白[矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor-2, RUNX2)、ALP和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)]、叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1, FOXO1)和(phospho-FOXO1, p-FOXO1)表达水平。随后采用FOXO1抑制剂AS1842856(100 nmol/L)处理细胞, 实验分为对照组、H2O2+二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组、LIPUS+H2O2+DMSO组和LIPUS+H2O2+AS1842856组。CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞活力; DCFH-DA探针检测各组细胞ROS水平, WB检测各组RUNX2、ALP和OPN的蛋白表达情况。结果发现与空白对照组相比, H2O2组ROS与MDA水平均升高, 抗氧化酶蛋白表达下调(P<0.000 1); ALP和茜素红阳性染色以及成骨相关蛋白表达水平均显著降低(P<0.000 1); p-FOXO1/FOXO1蛋白值上升(P<0.000 1)。与H2O2组比较, LIPUS+H2O2组的ROS与MDA水平均下降, 抗氧化酶蛋白表达上调(P<0.0001); 成骨染色及相关蛋白表达量显著增加(P<0.000 1); p-FOXO1/FOXO1蛋白值降低(P<0.000 1)。相较于LIPUS+H2O2+DMSO组, LIPUS+H2O2+AS1842856组细胞活力下降, p-FOXO1/FOXO1蛋白表达上调, ROS水平升高且成骨分化相关蛋白表达量显著降低(P<0.000 1)。研究结果显示LIPUS通过调节FOXO1的磷酸化水平, 发挥抗氧化防御作用并提高氧化损伤的hPDLSCs成骨分化能力。