具核梭杆菌通过调节肠道代谢产物丁酸钠上调Cdk1促进结直肠癌发展

该文探讨了肠道微生物具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)通过调节代谢产物丁酸钠(NaB)对结直肠癌(CRC)发生发展的影响及其分子机制。提取临床组织RNA和蛋白, RT-qPCR和Western blot检测肿瘤组织与正常/癌旁组织Cdk1的mRNA及蛋白表达, 同时检测具核梭杆菌的mRNA的相对水平, 并分析其与Cdk1的相关性。具核梭杆菌处理结直肠癌细胞24 h后检测周期相关蛋白Cdk1和P21的表达水平, 核磁共振检测培养基上清差异代谢物。不同浓度差异代谢物NaB处理结直肠癌细胞DLD-1、SW480、HCT116, 使用MTT和克隆形成实验检测DLD-1、SW480、HCT116增殖能力。流式细胞术检测NaB对结直肠癌细胞SW480周期阻滞位点, Western blot检测周期相关蛋白Cdk1、P21、C-myc的表达水平。流式细胞术检测NaB处理后结直肠癌细胞SW480凋亡率变化情况, Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP、Bcl-2的表达水平。采用MTT实验检测不同MOI具核梭杆菌作用结直肠癌细胞4、8、24 h后对其增殖能力的影响。将结直肠癌细胞与具核梭杆菌共培养24 h, Western blot检测相关蛋白Cdk1、c-myc、Cleaved-Caspase3的表达情况。结果显示, 在肿瘤组织中Cdk1蛋白水平和mRNA水平均明显高于正常/癌旁组织(P<0.05), 并且Cdk1与具核梭杆菌mRNA表达水平存在一定相关性。具核梭杆菌处理结直肠癌细胞DLD-1和HCT116后, Western blot结果显示Cdk1和P21蛋白水平上升。核磁共振结果表明, 菌处理组代谢模式与未处理组存在明显差异, 主要代谢物NaB相对含量明显低于未处理组(P<0.01)。使用1 mmol/L NaB处理结直肠癌细胞系DLD-1、SW480、HCT116 24 h后, 细胞生存率分别为(89.18±1.92)%、(85.07±0.61)%、(83.59±2.18)%, 且随着药物浓度升高, 药物对细胞活性的抑制率逐步上升。同时, 经1 mmol/L NaB处理后, DLD-1、HCT116和SW480细胞的克隆形成率相比于对照分别下降了(20.07±4.85)%、(36.47±5.31)%、(31.13±5.22)%。流式检测细胞周期显示, NaB引起结直肠癌细胞S期阻滞。NaB处理结直肠癌细胞24 h后, 周期相关蛋白P21表达水平上升, Cdk1、C-myc蛋白表达水平下降(P<0.05)。流式检测细胞凋亡显示, NaB引起结直肠癌细胞SW480凋亡增加。NaB处理结直肠癌细胞24 h后, 凋亡相关蛋白Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP表达水平上升, 抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。MOI=50的具核梭杆菌分别处理结直肠癌细胞SW480、HCT116 4 h后, 细胞增殖率分别增加了(4.45±0.25)%、(2.61±0.75)%; 并且随着具核梭杆菌MOI的增加和处理时间的延长, 结直肠癌细胞的增殖率逐渐上升。将SW480细胞与HCT116细胞与具核梭杆菌共培养24 h, Western blot结果显示, 具核梭杆菌感染促进了周期相关蛋白Cdk1、C-myc的表达, 而其与NaB共同处理时则大大减弱了这一作用; NaB诱导Caspase3的剪切, 导致Cleaved-Caspase3表达增加, 而具核梭杆菌感染则减弱了这一作用。综上所述, 肠道微生物具核梭杆菌通过调节肠道代谢物NaB上调Cdk1, 促进结直肠癌细胞增殖, 抑制结直肠癌细胞凋亡, 进而影响结直肠癌的发生发展。