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重组人可溶性TIM-3稳转细胞株的构建及其分泌蛋白的表达


李强 陈明 黄飚 王毅刚*

(浙江理工大学, 生命科学与医药学院, 杭州 310018)
摘要 :

该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable, TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达。设计特异性引物PCR扩增TIM-3(Fc)片段, 重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆, 无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒, 再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞, 最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3。再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达, 用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力。成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体, qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明, 293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白。成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白, 为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础。