利用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293/K562细胞株

张虹洋舒逸朱丹张佳邹琳张鹏辉*

重庆医科大学附属儿童医院临检中心; 儿童发育疾病研究教育部重点实验室; 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心(重庆); 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地; 重庆市干细胞治疗工程技术研究中心, 重庆 400014

摘要 :

该文旨在利用CRISPR/Cas9构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293/K562细胞株, 为 G6PD缺陷症及其修复研究提供细胞模型。针对G6PD基因c.1388G>A位点设计单链向导RNA(sgRNA) 与突变同源臂, 利用CRISPR/Cas9联合同源重组修复(HDR)构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293 细胞株与红白血病K562细胞株; qRT-PCR、Western blot检测G6PD基因表达; CCK8检测细胞增殖; G6PD/6PGD比值法检测G6PD酶活性; 结晶紫染色与Annexin V-APC/7-AAD验证突变细胞株对氧化活性药物维生素K3与伯安喹的耐受情况。结果显示, 成功构建CRISPR/Cas9双质粒载体系统; 筛选单克隆细胞经测序鉴定显示, 成功构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293与K562细胞株, 且无脱靶; 进一步发现, c.1388G>A突变不影响HEK293与K562细胞G6PD基因mRNA转录与蛋白翻译, 但细胞增殖减慢, G6PD酶活性下降; 突变HEK293细胞对维生素K3与伯安喹的耐受力减弱, 突变K562细胞对伯安喹耐受能力减弱。该研究成功构建G6PD基因c.1388G>A突变的HEK293与 K562细胞株, 为G6PD缺陷症及后期基因修复研究提供细胞模型。