基于CRISPR/Cas9技术构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株及其生物学功能检测

为了探讨Cyr61的生物学功能, 该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Cyr61敲低的HEK293T稳定细胞株, 并在体外研究Cyr61对HEK293T细胞增殖和凋亡的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则, 应用http://crispr.mit.edu/在线设计3条Cyr61的导向RNA(guide RNA, gRNA),用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-gRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中, 经筛选后包装成Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒, 利用Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒和HDR质粒转染HEK293T细胞, 加入嘌呤霉素(8 μg/mL)进行筛选, 通过实时荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定出HEK293T敲低Cyr61细胞株; 常规培养细胞, 利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)检测细胞增殖情况, 流式细胞技术检测细胞凋亡情况。该研究成功构建出Cyr61敲低HEK293T细胞株, 与对照组相比, Cyr61敲低细胞株的增殖明显升高(P<0.05), 凋亡率明显减少(P<0.05)。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株, 为研究Cyr61基因提供了有效的工具。