黄色荧光蛋白的结构对Annexin A5凋亡检测功能的影响探究

摘要 : 细胞凋亡早期, 磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧, Annexin A5可与 PS高亲和力结合, 这是其检测凋亡的原理。绿色荧光探针标记的Annexin A5和碘化丙啶联合标记 应用于流式细胞术进行细胞凋亡检测, 该方法灵敏度高、特异性好、效率高, 已成为目前全世界 通用的细胞凋亡检测方法。除FITC-Annexin A5外, Annexin A5-EGFP融合蛋白是另一个常用的简 单、可信、易于制备的凋亡检测探针。黄色荧光蛋白是绿色荧光蛋白的一种突变体, 其荧光向红 色光谱偏移。目前, 有三种改良的黄色荧光蛋白: Citrine、Venus、Ypet, 这三种改良的蛋白荧光 更亮、更稳定、成熟更快。该文选择Citrine、Venus、Ypet来制备Annexin A5凋亡检测探针, 通过 原核表达和分离纯化Annexin A5-Citrine、Annexin A5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白, 获得了 高产量的可溶性蛋白, 探究这三种融合蛋白与凋亡细胞的结合能力, 筛选出适用于流式检测的黄 色荧光蛋白标记的Annexin A5, 为后续研究奠定基础。以pET28a-Annexin A5-EGFP-his重组质粒 为模板, 利用分子生物学手段又构建了重组质粒pET28a-Annexin A5-Citrine-his、pET28a-Annexin A5-Venus -his、pET28a-Annexin A5-Ypet-his, 然后通过Ni柱亲和层析纯化获得了这三种蛋白, 纯度约为90%。该文重点比较了三者检测细胞凋亡的能力, 流式细胞仪检测结果显示, Annexin A5- Citrine、Annexin A5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白均可以识别和标记凋亡细胞, 它们与凋亡细 胞的亲和力分别是3 113.0 nmol/L、444.3 nmol/L和391.6 nmol/L。三者与凋亡细胞的亲和力差异很 大, 通过对Citrine、Venus、Ypet的氨基酸序列进行分析, 该文初步发现了决定三个黄色荧光蛋白与凋亡细胞亲和力的关键氨基酸。