利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系

摘要 : 该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系, 并初步将 其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA, 并克隆至pX459载体。 将重组质粒转染A549/293T细胞, 嘌呤霉素初步筛选, 通过PCR后测序和Western blot技术检测发 现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现, 存在碱基缺 失, Western blot结果显示, 对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白, 可见成功获得了VPS34敲除的 A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始, 实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显 著被抑制, 自噬底物P62大量累积。结果表明, 该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细 胞系, 且细胞中的自噬被显著抑制。同时, 敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实 验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系, 为后续 自噬功能研究提供有力工具。