双特异性磷酸酶5过表达/干扰RAW264.7 细胞株建立及其对自噬调控的影响

为探究双特异性磷酸酶5(dual-specificity phosphatase 5, DUSP5)在巨噬细胞RAW264.7 自噬中的调控作用, 该研究采用慢病毒转染的技术方法建立DUSP5过表达/干扰RAW264.7细胞 株, 并用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin, Rapa)和抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1, Baf A1) 分别对其进行刺激, 使用蛋白免疫印迹技术(Western blot)、荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)、单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine, MDC)染色以及免疫荧光等方 法探究过表达或抑制DUSP5后对巨噬细胞RAW264.7自噬的影响。结果显示: DUSP5过表达/干扰 慢病毒转染RAW264.7可显著提高/抑制DUSP5 mRNA和蛋白的表达量(P<0.01); Rapa刺激后, 过表 达DUSP5抑制自噬相关蛋白Beclin1和LC3II表达且自噬体形成减少, 而抑制DUSP5表达结果与此 相反; 用Baf A1阻断DUSP5干扰RAW264.7稳定转染细胞株自噬流, DUSP5干扰RAW264.7稳定转染 细胞株中LC3II表达量和自噬体数量均显著上调(P<0.01)。由此说明, DUSP5参与调控巨噬细胞自 噬, 可能通过抑制自噬体合成来阻碍巨噬细胞自噬进程。此结论为进一步探究巨噬细胞自噬调控机制提供了新的研究思路。