应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中 Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用

人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子, 在体内多个环节中都发挥着重要的作用, 尤其是在神经系统中, 它与神经元的发育, 突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sgRNA序列, 合成相应的寡核苷酸后克隆在pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上, 从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPA/Cas9质粒, 将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定, 将经过鉴定证实相位正确及在有sgRNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中, 加入嘌呤霉素进行抗性筛选, 保留正常生长的细胞进行培养, 从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测 Purα基因的表达情况, 从而来判定Purα基因的敲除效率; 将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲 (HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型, 通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及 细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。 实验结果证实, 所插入片段相位正确。通过 TA 克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性, 可导致基因组碱基发生突变, Real-time PCR和Western blot实验结果证实, Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后, 细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感, 说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用, 是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示, 利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除, 同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因, 利用这一特点, 可以方便地建立稳定的细胞系, 该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。