CRISPR系统介导的小鼠细胞染色体标记

摘要 : 细胞基因组生物学功能的发挥依赖于其染色质空间组成方式和动态活动, 而对染色体的动态变化进行研究的首要任务, 就是通过一种简单而有效的方法实现基因组中特定序列的标记。近年来, 随着CRISPR技术的发展, 应用其对特定基因进行标记将成为研究染色体动态变化的有力手段。该研究中, 对CRISPR系统的sgRNA支架序列进行F+E修饰, 增强了dCas9蛋白复合体对DNA的结合能力, 获得支架序列增强型CRISPR(enhance sgRNA scaffold-CRISPR, Esgs-CRISPR)系统。接着, 进一步将Esgs-CRISPR标记系统与PB转座系统以及Tet-on系统相结合,构建了适用于稳定标记细胞的质粒系统, 即PB-Tet-on-Esgs-CRISPR(PTE-CRISPR)系统。在PTE-CRISPR质粒中插入特定的sgRNA序列, 通过脂质体转染成功标记了小鼠神经瘤母细胞(mouse euroblastoma cell line-2A, N2A)的端粒和卫星序列。通过与表达转座酶(PB transposase, PBase)的质粒共转染小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESC),该研究成功标记了mESC的端粒及卫星序列, 并通过流式细胞术筛选获得了标记端粒和卫星序列的稳转细胞系。该研究实现了CRISPR系统介导的mESC染色体特定基因序列的标记, 为进一步研究活细胞内染色体结构和动态变化提供了基础。