盘基网柄菌尿囊酸酶基因RNA干扰载体的构建及干扰效果鉴定

摘要 : 为探究尿囊酸酶(allantoicase)基因在盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)发育中的作用， 依据RNA干扰(RNAi)的原理和盘基网柄菌中构建RNAi载体的基本经验， 扩增出尿囊酸酶基因642 bp的长片段， 397 bp的短片段，并反向连接成含有发卡结构的寡核苷酸片段， 克隆至表达载体pAct15Gal， 构建了以盘基网柄菌尿囊酸酶基因为靶标的RNAi载体pAct15Gal-allCi。将此载体转染野生型KAx-3细胞， 经G418筛选出阳性克隆RNAi-allc。将野生型细胞和RNAi-allc转染细胞发育20 h后发现， 转染细胞仅能形成类似细胞丘的小突起， 不能完成完整的发育， 而野生型细胞则能完成完整的发育， 形成子实体。Western 印迹几乎检测不到转染细胞有尿囊酸酶的免疫条带; 流式细胞术检测转染细胞内尿囊酸酶的表达， 发现表达率由野生型细胞的72.18%降为转染细胞的0.67%。表明本研究设计的核苷酸序列对靶标基因的表达有较明显的干扰作用， 说明尿囊酸酶对盘基网柄菌细胞发育有一定的调控作用。