利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因表达的调控作用

郭姗姗¹ 张冰莹² 何文欣¹ 石晓光¹ 刘昆梅¹ 孙涛¹ 崔建奇^1,2*

¹宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室, 省部共建国家重点实验室培育基地, 银川 750004;²宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系, 银川 750004

摘要 : 环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein, CREB)是重要的核转录因子, 有研究表明, 在阿尔茨海默病患者中, CREB的表达降低, 但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的作用机制尚不清楚。该研究通过设计sgRNA序列并合成相应的寡核苷酸, 将其克隆到pX459质粒中, 构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体。将构建成功的载体转染到HT22细胞中, 通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sgRNA的活性。将构建的载体转染到HT22细胞中, 用嘌呤霉素进行药物筛选, 构建稳定的CREB基因敲除的细胞系。CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认。结果显示, 成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体, 所设计的sgRNA的插入序列和开放阅读框架完全正确, 经过酶切分析和序列测定, 所构建的载体与实验设计相一致。CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90%以上。通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响, 结果发现, 当CREB基因敲除后, APP表达增加, 而过表达CREB时, 则APP蛋白质表达水平下降。这提示, CREB对APP的表达有下调作用, 具体的机制还将继续研究。