大鼠晚期糖基化终产物受体基因特异性小干扰RNA表达载体的构建及其活性鉴定

摘要 : 应用两个RNA干扰实验技术网络的RNA设计软件， 模拟SD大鼠晚期糖基化终产物受体(RAGE) mRNA的二级结构， 设计针对RAGE mRNA 417、221和534位点的3对小干扰RNA(siRNA)序列(21 nt)， 再转化为能表达其小发夹结构RNA(shRNA)的寡核苷酸序列， 分别将其克隆于pGCsi-U6/Neo/GFP载体， 利用酶切和序列分析鉴定克隆的正确性。将RAGE特异性siRNA表达克隆转染肝星状细胞(HSC)-T6细胞系， 以空白及转染非特异性siRNA表达克隆作为对照， 分别以实时荧光定量PCR和Western印迹法检测各组HSC-T6细胞RAGE 基因和蛋白质的表达。结果显示: 成功构建了RAGE特异性siRNA重组表达载体pGCsi-R1、pGCsi-R2、pGCsi-R3和非特异性siRNA重组表达载体pGCsi-C， 与对照组相比， 转染特异性siRNA重组表达载体的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达受到明显抑制， 在0.25~1.0 nmol/L范围内， RAGE mRNA下调幅度呈浓度依赖性增加， 以1.0 nmol/L pGCsi-R1最显著， 转染pGCsi-C的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达水平无明显变化。转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞24、48和72 h表达的 RAGE mRNA分别较空白对照组下调(79.65±8.88)%、(78.96±7.94)%和(73.11±6.89)% (F=71.397， 61.824， 61.98， P均<0.01)， 在72 h范围内， RAGE mRNA下调幅度呈时间依赖性降低。同时，转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞50kDa和46kDa的RAGE、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)mRNA及蛋白质的表达也明显下调，分别为空白对照组的(43.91±1.18)% (F=386.19， P<0.01)、(36.33±0.78)% (F=386.07， P<0.01)、(57.53±3.25)% (F=20.91， P<0.05)和(58.48±3.08)% (F=56.59， P<0.05)。结果表明: pGCsi-R1表达的特异性siRNA可高效抑制HSC-T6细胞中RAGE基因和蛋白质的表达及肝星状细胞的激活。