非瑟素对HBV复制诱导的细胞氧化损伤的保护作用及其机制研究

摘要 : 该文旨在研究sirtuin家族激活剂非瑟素(fisetin)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制导致的氧化损伤过程中的保护作用, 并初步分析其分子机制。在Huh-7细胞中转染HBV表达质粒pCH9/3091并同时用N-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-cysteine, NAC)处理细胞, MitoSOX™ Red试剂检测细胞线粒体活性氧类(reactive oxygen species, ROS)水平, DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平, 丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒检测细胞MDA水平, Western blot检测细胞超氧化物歧化酶1(superoxidedismutase 1, SOD1)和SOD2的蛋白质水平。Huh-7细胞转染pCH9/3091的同时用非瑟素处理细胞, 并检测细胞ROS、MDA、SOD1和SOD2蛋白质水平; Huh-7细胞转染pCH9/3091并用非瑟素处理细胞或同时沉默SOD2, 用细胞免疫荧光及Western blot检测γ-H2AX(Phosphorylated Histone H2AX)的形成;MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt]实验分析氧化应激条件下非瑟素对HBV复制细胞活率的影响; 进一步应用Western blot检测丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族磷酸化水平及总蛋白水平的变化。结果显示, HBV复制明显增加细胞线粒体和细胞内ROS水平和细胞MDA水平, 并且也明显降低SOD1和SOD2水平。NAC处理HBV复制细胞后, 线粒体内和细胞内的ROS和细胞MDA水平明显减少。非瑟素处理HBV复制细胞后, HBV复制对细胞内ROS和MDA水平促进作用明显减弱; 此外, HBV复制对细胞内SOD1和SOD2水平的抑制作用也明显减弱。非瑟素处理HBV复制细胞后, HBV复制对γ-H2AX形成的促进作用明显减弱, 而SOD2沉默则减弱了非瑟素对HBV复制细胞中γ-H2AX形成的抑制作用。在氧化应激条件下, 非瑟素明显减弱HBV复制对细胞活力的影响, SOD2沉默则减弱了非瑟素对HBV复制细胞活率的影响。非瑟素拮抗HBV表达对JNK(c-Jun N-terminal kinase)和p38(p38 kinase)磷酸化的促进作用, 而SOD2沉默减弱了非瑟素对HBV复制细胞中JNK和p38磷酸化的抑制作用。该研究结果表明, 非瑟素可能通过促进SOD2的表达拮抗HBV复制导致的氧化应激反应, 并可能通过抑制JNK及p38的激活减少细胞氧化损伤, 从而发挥保护细胞的作用。