冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞iNOS、TLRs表达以及凋亡的影响

摘要 : 冠蛋白-1(Coronin-1)在真核细胞中广泛表达, 涉及钙离子稳态、细胞骨架动力学、免疫及炎症反应等多种细胞功能。该研究探讨了冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)表达和凋亡的影响并探讨其分子机制。根据冠蛋白-1表达水平的差异, 实验细胞分为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus 3组。各组细胞分别经4 μmol/L钙调磷酸酶抑制剂环孢素A(cyclosporin A, CsA)处理24 h或2 μmol/L肌动蛋白聚合抑制剂松胞菌素D(cytochalasin D, cytD)处理48 h, 同时设未处理对照, 再分别用Real-time PCR法检测iNOS mRNA水平, Western blot法检测细胞TLR2、TLR4、TLR9及钙调磷酸酶(calcineurin, CaN)的蛋白质水平, 流式细胞术检测细胞凋亡百分率。各组细胞用四甲基异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)染色后, 计算纤维型肌动蛋白(F-actin)重排率。结果显示, 冠蛋白-1过表达细胞相对于冠蛋白-1正常表达细胞, 其iNOSmRNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05); CsA作用后,RAW264.7-Cor.Plus的iNOS mRNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白质水平和细胞凋亡率均较未处理对照细胞显著增加(P<0.05), RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus细胞的CaN水平较未处理对照细胞显著降低(P<0.05); cytD作用后, 与未处理对照细胞相比, iNOS mRNA水平及细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05), 但TLRs的表达显著降低(P<0.05); 经鬼笔环肽染色后, RAW264.7-Cor.Plus细胞F-actin重排率显著高于RAW264.7细胞(P<0.05)。以上结果表明, 冠蛋白-1过表达不仅促进了巨噬细胞F-actin重排, 而且下调了iNOS、TLRs水平并且抑制细胞凋亡, 其分子机制与冠蛋白-1促进钙调磷酸酶调控的Ca2+信号通路有关。