山羊精原干细胞的鉴定及培养体系优化的研究

张钦恺¹ 姜颖¹ 王明明¹ 董焕声¹ 尉玉杰² 潘庆杰^1*

¹青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所, 青岛 266109;
²山东省莱阳市畜牧兽医局, 烟台 265200

摘要 : 该研究优化了山羊精原干细胞(goat spermatogonial stem cells, gSSCs)培养体系, 使山羊精原干细胞能在体外长期培养, 维持自我更新的能力并保持未分化状态。取3~5月龄山羊睾丸,采用两步酶消法结合差速贴壁方法得到山羊精原干细胞悬液, 分别通过形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)染色、特异基因表达及蛋白质水平的分析对培养的细胞进行鉴定; 并以山羊睾丸支持细胞(goat sertoli cells, gSCs)、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和层黏连蛋白(laminin, L)为饲养层, 观察饲养层对山羊精原干细胞体外增殖的影响。结果表明, 山羊精原干细胞体外增殖形成克隆簇, AKP染色呈阳性。经RT-PCR检测, Oct-4、C-myc、CyclinD1、Ngn3和TERT等干细胞特异基因均有表达。细胞免疫组化结果显示, Oct-4、SSEA-1、α6-integrin、Vasa和Thy-1蛋白质呈阳性。克隆簇统计显示, 在山羊睾丸支持细胞上形成的山羊精原干细胞(goat spermatogonial stem cells, gSSCs)克隆数与其他两组比较差异显著(P<0.05)。山羊睾丸支持细胞饲养层上的精原干细胞可在体外传3~4代, 培养时间为2个月。结果证明, 通过两步酶消法和差速贴壁法可以分离获得山羊精原干细胞, 且山羊睾丸支持细胞能够促进gSSCs的增殖。