CRISPR/Cas9切割痘病毒DNA抑制病毒复制

王娇娇¹ 张新敏¹ 倪爱民² 章康健² 刘新垣^1,2 刘锡君^3*

¹浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所, 杭州 310018; ²中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031; ³同济大学附属第十人民医院泛血管疾病研究所, 上海 200072

摘要 : 当前, CRISPR/Cas9系统靶向痘苗病毒的相关研究鲜有报道。该文采用了CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术, 以痘病毒为研究对象。在重组痘病毒WR-EGFP中针对EGFP基因序列设计不同靶点gRNAs, 转染Cas9/gRNA质粒, 同时感染WR-EGFP痘病毒, 随后观察EGFP荧光表达、提取病毒基因组, 通过PCR进行切口鉴定并运用错配酶切法验证CRISPR/Cas9对痘病毒靶点DNA切割的切口修复情况。与单独感染WR-EGFP组相比, 转染了Cas9/gRNA174和Cas9/gRNA175质粒的EGFP荧光强度明显降低, 表明CRISPR/Cas9抑制WR-EGFP病毒中EGFP基因的表达。相对定量PCR及错配酶切实验结果显示, CRISPR/Cas9切割靶点导致WR-EGFP病毒基因组产生了切口, 并且存在DNA错配修复现象。最后, 通过结晶紫染色法测定痘病毒的滴度, 结果显示, 经CRISPR/Cas9处理组的痘病毒滴度显著下降, 即CRISPR/Cas9能够使痘病毒的复制能力显著地降低。综上所述,CRISPR/Cas9切割痘病毒基因组DNA并且抑制痘病毒复制。