基于FRET技术MMP-9生物传感器的构建及鉴定

王琰¹ 饶烽¹ 崔钢华¹ 刘伟² 曹薇薇² 史晨辉^1,2 王维山^1,2*

¹石河子大学医学院第一附属医院骨科, 石河子 832000; ²新疆民族与地方病教育部重点实验室, 石河子 832000

摘要 : 为了构建包含有增强青色荧光蛋白-MMP-9-黄色荧光蛋白(ECFP-MMP-9-YPet)融合蛋白的真核表达质粒MMP-9生物传感器, 利用原有质粒Src biosensor和通用载体pMD-18T, 通过基因工程的方法构建ECFP-MMP-9-YPet生物传感器并进行鉴定, 转染293T细胞24 h后观察转染效率,然后加MMP-3刺激293T细胞, 运用荧光共振能量转移(flurorescence resonance energy transfer, FRET)技术在荧光显微镜下观察MMP-9生物传感器的荧光共振能量转移现象。PCR和双酶切鉴定显示,ECFP-MMP-9-YPet生物传感器构建成功, 293T细胞转染效率约40%。用免疫荧光法检测MMP-9生物传感器融合蛋白在293T细胞表面膜表达, 用MMP-3刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结果表明, 基于FRET构建的MMP-9生物传感器可以敏感而准确地监测活细胞中MMP-9的表达情况。