两种真核启动子体内外转录活性比较研究

摘要 : 启动子作为基因工程表达载体的核心组成部分, 在很大程度上决定了目的基因的转录活性。为筛选出一个转录活性较高的真核启动子, 以目的蛋白与增强型绿色荧光蛋白融合表达的形式, 在体内外检测CMV和CAG两种真核启动子的转录活性。首先, 通过常规分子生物学技术将神经钙黏着蛋白(N-cad)克隆到pCAG-MCS-EGFP质粒中(携带CAG启动子), 菌落PCR、双酶切及测序验证; 与pEGFP-N-cad质粒(携带CMV启动子)一起通过磷酸钙法分别转染HEK293T细胞, 比较两种质粒在体外细胞水平转染目的基因效率; 随后, 通过已建立的鸡胚脊髓活体电转方法比较两种质粒在活体鸡胚脊髓内转录目的基因效率, 冷冻切片后进行荧光强度观察; 而体内外实验均应用常规Western blot和RT-PCR技术验证目的基因N-cad在蛋白及基因水平上的表达。荧光显微镜观察结果表明, CMV启动子仅能在体外细胞水平上行使其转录活性, 而CAG启动子可在体内体外高效行使其转录活性, 进一步的Western blot和RT-PCR结果与荧光观察结果一致。该研究结果可为体内研究目的基因功能时的载体构建提供借鉴。