建立高效表达猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系

杨宁^# 赵丽华^# 张曼玲金永侯道荣吴兆强陈袁李荣凤^*

南京医科大学江苏省异种移植重点实验室, 南京 210029

摘要 : 该文目的是建立高效表达重组猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)的猪
胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts, PEF)系PEF-pLIF, 为下一步辅助建立和培养猪naïve胚胎干细胞奠定基础。以猪胚胎成纤维细胞的总RNA为模板, 利用RT-PCR的方法扩增猪白血病抑制因子基因(LIF), 将LIF cDNA连接到真核表达载体pCAGDNA3的启动子下游, 构建LIF基因真核表达载体pCAGDNA3-pLIF; 利用核转染的方法将pCAGDNA3-pLIF质粒转入PEF; 对转染细胞进行G418筛选, 得到稳定高效表达重组猪LIF的PEF-pLIF; 利用RT-PCR、Western blot鉴定PEF-pLIF中LIF基因及LIF表达情况; 使用PEF-pLIF细胞作为饲养层培养小鼠胚胎干细胞, 通过对小鼠胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色及细胞免疫荧光染色, 对PEF-pLIF维持干细胞干性功能进行初步验证。实验结果显示, 成功构建了真核表达载体pCAGDNA3-pLIF; 并将其成功转入PEF中, 获得高效表达重组猪LIF的PEF-pLIF; 以PEF-pLIF作为饲养层成功培养克隆形态正常的小鼠胚胎干细胞。该研究表明, 稳定高效表达重组猪LIF蛋白的猪胚胎成纤维细胞系PEF-pLIF可作为饲养层维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态, 可为下一步建立及培养猪naïve胚胎干细胞提供条件。