高活性β-内酰胺酶的分离、表达和性质

摘要 : 应用DNA家族改组方法制备TEM型β-内酰胺酶基因突变文库， 利用平皿初筛和琼脂稀释法复筛获得一株酶活力增高的突变体bla_TEM^m。带有该突变基因的大肠杆菌， 其最低抑菌浓度(MIC)比带有野生型bla_TEM 的大肠杆菌高2~4倍(氨苄青霉素)、4~8倍(头孢唑啉)、4~8倍(头孢呋辛)、16~32倍(头孢他啶)、8倍以上(头孢曲松)和4~8倍(头孢噻肟)。在 E. coli BL21(DE3)高效表达bla_TEM和bla _TEM^m， 利用离子交换柱层析和凝胶过滤层析对包涵体进行柱上复性和纯化， 获得纯度达90%的重组蛋白质。酶动力学分析显示， 与野生型蛋白相比， 突变蛋白酶促反应的k_cat/K_m值分别增加1.5倍(青霉素G)、4.4倍(氨苄青霉素)、3.1倍(头孢唑啉)、2.8倍(头孢他啶)， 但是对头孢噻肟的k_cat/K 下降了2.5倍。DNA序列分析显示bla_TEM^m发生7处碱基置换， 造成4个氨基酸改变， 即S59G、R164S、A237T和E240K。应用Swiss-Pdb Viewer3.7软件预测蛋白质的三维结构， 显示这些突变不影响酶的活性中心， 但是变异造成的蛋白质空间结构的细微变异增加了酶和底物的亲和性。