非贴壁微球体培养法分离T-淋巴细胞瘤干细胞及鉴定

摘要 : 通过非贴壁微球体无血清培养法, 体外构建并鉴定了T-淋巴细胞瘤干细胞。采用细胞球悬浮培养方法富集T-淋巴细胞肿瘤干细胞, 利用抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074(2i)进行肿瘤干细胞的筛选, 采用RT-PCR法检测Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc干细胞特征基因的表达, 进一步采用Western blot验证Oct4蛋白水平表达, 流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达情况, 用PI检测细胞周期, 用CFSE观察细胞增殖能力, 并将富集的T-淋巴细胞肿瘤干细胞进行裸鼠异体移植实验。在细胞球悬浮培养法基础上, 利用具有抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074, 成功富集出Hut-102干细胞球。经RT-PCR鉴定, Hut-102干细胞球的其干细胞特征基因Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc表达均显著性高于Hut-102细胞并且高表达Oct4蛋白; 经流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达, 有74.20%的Hut-102干细胞球表现为CD34+, 有90.82%的Hut-102干细胞球表现为CD44+, 证明抑制分化药物应用于细胞球悬浮培养方法中, 能够有效富集出具有CD34+CD44+表型特征的Hut-102干细胞球; 用PI检测细胞周期, 富集的Hut-102干细胞球中处于G1/G0期的细胞为64%, 处于S期的细胞为30.56%, 表明该细胞暂不增殖或处于休止状态; 用CFSE检测到富集的Hut-102干细胞球分化增殖能力显著高于Hut-102细胞。在NON/SCID裸鼠中, 分别移植Hut-102细胞球和Hut-102细胞, 结果显示, 前者检测到67.74%±5.32%的淋巴细胞表达Hut-102细胞特异性标记物(CD3), 而后者的裸鼠中未检测到, 说明Hut102细胞球在NON/SCID裸鼠体内表现了T-淋巴细胞肿瘤干细胞特点和移植能力。首次在传统的非黏连微球体无血清培养法中加入两种抑制剂(CHIR99021和PD173074), 富集出大量的微球体, 通过干细胞特征鉴定及裸鼠移植实验, 证明Hut-102细胞球具有T-淋巴细胞肿瘤干细胞特性。