酿酒酵母TORC1信号通路重要调控元件Ego1/Ego3复合物的共表达及纯化

摘要 : 支架和连接蛋白在调节信号级联传导中起着重要作用。最近, Ego1/Ego3蛋白复合物被证实作为定位在细胞内体膜表面的支架蛋白在TORC1信号通路感知氨基酸丰度方面发挥重要调控作用。研究中通过克隆酵母Ego1与Ego3基因, 构建了双T7启动子的双元原核表达载体。通过在大肠杆菌中共表达、共破菌以及带有不同抗性的两个质粒共转化的方法来重组表达Ego1/Ego3复合物。结果发现, Ego1可与Ego3蛋白形成可溶性的复合物, 但纯化后蛋白比例存在明显差异, 且Ego1有降解现象。通过构建一系列带组氨酸标签截短的Ego1与全长Ego3共表达, 依靠pulldown纯化来鉴定Ego1与Ego3相互作用的区段。最终发现, 共转化pRSFDuet-mcs1Ego1(35-184)和pACYDuet-mcs1Ego3可共表达、纯化到较稳定的比例较一致的复合物, 从而为进一步对Ego1/Ego3蛋白复合物进行生化鉴定和结构生物学研究奠定了基础。