靶向DENN-SV基因的shRNA真核表达载体的构建

骆振华¹　李锦成^1*　张秀梅²　冯　卓¹

¹辽宁医学院附属第一医院乳腺外科, 锦州 121000; ²辽宁医学院附属第一医院心内科, 锦州 121000

摘要 : 该研究根据DENN-SV序列及shRNA设计原则, 设计四个靶点序列, 退火后用DNA重组技术与pRNAi-U6.1/Neo空载体连接, 转化到感受态E.coli中。扩增菌株, 抽提质粒, 进行酶切、DNA测序鉴定。将重组的真核表达载体转染人乳腺癌MCF-7细胞并使用RT-PCR及Western blot检测其抑制DENN-SV mRNA表达的效率, 以MTT法绘制生长曲线。测序结果与设计序列相同, 并已成功转染进入人乳腺癌MCF-7细胞, 可见GFP(绿色荧光蛋白)表达, 且都具有抑制作用(P<0.01), DS-1组的抑制效果最好; MTT法绘制生长曲线结果表明, 实验组经该载体转染后细胞增殖程度显著减少(P<0.05)。该研究应用RNAi技术成功构建了小干扰RNA重组体, 为进一步研究乳腺癌基因治疗奠定了基础。