MEKK2基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEKK2的表达抑制

摘要 : 设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列， 将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中， 并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞， 包装得到具有感染能力的pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞， Western blot印迹法检测其对MEKK2表达的抑制。经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒载体构建成功，其插入序列正确无误。Western blot印迹检测结果显示， 重组腺病毒表达载体可抑制MEKK2基因的表达， 以pAd-MEKK2-siRNA2(针对MEKK2 cDNA 992-1 010的片段)抑制效果为最佳， pAd-MEKK2-siRNA1(针对MEKK2 cDNA 1 456-1 474的片段)和pAd-MEKK2-siRNA3(针对MEKK2 cDNA 1 351-1 369的片段)则未见明显的抑制效果。DNA Ladder和细胞存活测定结果表明， 敲减MEKK2的表达后， AGS细胞接受H2O2刺激后的凋亡受到较强抑制、细胞存活数增加， 明显高于野生型细胞和转导siRNA阴性对照腺病毒细胞接受H2O2刺激后的， 差异具有统计学意义(P<0.05)， 而后两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。该研究成功地构建了针对MEKK2基因的siRNA重组腺病毒载体， 为进一步深入研究MEKK2基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础。